今天推送的文章是发表在Food Chemistry上的“
Improvement of stability and lipophilicity of pelargonidin-3-glucoside by enzymatic acylation with aliphatic dicarboxylic acid
”，通讯作者是浙江大学生物系统工程与食品科学学院的陈卫教授。
花青素是常见的天然色素，一些基于花青素的化合物已被欧盟、美国以及亚洲国家的立法批准用作天然色素添加剂。 天竺葵素-3-葡萄糖苷 (Pg3G) 是最具代表性的花青素之一，存在于草莓和覆盆子中。Pg3G的生物活性近年来备受关注。大量证据表明，Pg3G具有潜在的积极健康作用，包括抗氧化、抗糖尿病、抗肥胖和抗炎。然而常见的花青素对pH、光照、热处理敏感，并且脂溶性相对较低，这限制了它们在食品工业中的应用。
酰化花青素是花青素与有机酸发生酰化反应的产物。天然酰化花青素中涉及的酰基类型很多，包括脂肪酸（例如乙酸、苹果酸和乳酸）和酚酸（例如没食子酸、对香豆酸、咖啡酸和阿魏酸）。大量研究证明，酰化花青素在稳定性和亲油性方面优于非酰化花青素。因此，近年来开发了酶促酰化反应来获得酰化花青素。这些研究大多采用Candida antarctica脂肪酶B(CALB)作为高效的催化剂，以脂肪酸为底物来获得较高的酰化率。
脂肪族二羧酸（如草酸、丙二酸和琥珀酸）也参与了草莓、谷物和其他植物的花青素的酰化。脂肪族二羧酸酰化的花青素特有一个游离羧基，形成两性离子，可改善结构稳定性或生物活性。然而，脂肪酰基部分和糖之间的连接对无机酸很敏感，这在花青素的提取和分离过程中很常见。此外，脂肪族酰基部分的检测和鉴定是复杂的，因为它们缺乏紫外/可见光吸收。因此，很难用二羧酸分离出足够量的酰化花青素以供进一步研究。因此，很少有研究集中在脂肪族二羧酸衍生物的酰化花青素的性质。
在这项工作中，作者合成并鉴定了Pg3G-二羧酸衍生物并研究了Pg3G及其酰化衍生物的亲脂性和热稳定性，随后探索了酰化 Pg3G 衍生物的热稳定性机制。
酰基供体和溶剂对酶促酰化反应的影响。花青素的酰化反应是一个可逆反应。在酰化反应过程中，酰基供体或溶剂对酰化反应的影响相对复杂。在本研究中，四种不同碳长的脂肪族二元酸(草酸、丙二酸、琥珀酸和戊二酸)作为酰基供体，24 h后Pg3G的转化率如图1A所示。结果表明，转化率与二元酸的碳链长度呈正相关。当以草酸为反应物时，未发现产物。丙二酸、丁二酸和戊二酸的转化率分别为6%~36%、60%~65%和70%~78%。如图1B所示，初始反应速度与二元酸的碳链长度相关，而反应在大约24小时达到平衡。在以前的研究中使用脂肪酸时也发现了类似的现象。二元酸对酰化效率的影响可能归因于其溶解性、疏水性和活性中心亲和力。
图1
溶剂不仅对反应物(酰基供体和花青素)的溶解性有关键影响，而且还影响与活性中心的相互作用，从而影响催化活性。在本研究中，三种常见的溶剂(乙腈、叔丁醇和叔戊醇)作为反应介质。以丁二酸和戊二酸为原料时，三种溶剂的转化率无明显差异。然而，当以丙二酸为反应物时，叔丁醇(28%)和叔戊醇(35%)的转化率显著高于乙腈(6%)(图1A)。因此，推荐叔丁醇和叔戊醇作为Pg3G与脂肪族二元酸进行酰化反应的反应介质。
Pg3G-二元酸衍生物的鉴定。采用半制备高效液相色谱系统分离所需的Pg3G-二元酸衍生物，并分别用LC-MS进行分析，分析表明酰化反应发生在糖苷部分。通过核磁共振研究进一步分析了Pg3G-二元酸衍生物的结构。分析表明二元酸与Pg3G的酰化反应发生在6’’-羟基。因此，初步的酰化产物鉴定为天竺葵素-3-(6’’-丙二酰基)葡萄糖苷、天竺葵素-3-(6’’-琥珀酸基)葡萄糖苷和天竺葵素-3-(6’’-戊二酰基)葡萄糖苷。该结果还表明酶促酰化具有区域选择性，这与之前的研究一致，而脂肪酸被用作酰基供体。
表1
图2
二元酸酰化增强亲脂性。为了确定Pg3G（1）及其酰化衍生物（2-4）的亲脂性，采用辛醇-水分配系数法，结果如图3所示。天竺葵素-3-(6’’-丙二酰基)葡萄糖苷、天竺葵素-3-(6’’-琥珀酸基)葡萄糖苷和天竺葵素-3-(6’’-戊二酰基)葡萄糖苷的对数P值分别为−1.18、−0.93、−0.74和−0.54。由于产物中存在游离羧基，与脂肪酸酰化相比，二羧酸酰化略微提高了花青素的亲脂性。因此，通过添加二元酸或脂肪酸的酶促酰化方法，可以在一定程度上提高花青素的亲脂性。
二元酸酰化提高了热稳定性。花青素在酸性条件下是稳定的，但在中性条件下相对不稳定。根据表1，降解速率常数(k)随温度升高而增大，半衰期(t1/2)随温度升高而减小。Pg3G在37℃、50℃和60℃时的半衰期分别为7.45h、3.96h和1.83h。相比之下，所有酰化衍生物的t1/2值在各个温度下都明显较大。在热降解过程中，Pg3G的Ea值(51.3kJ⋅mol−1)小于酰化产物的Ea值(53.0、69.3和69.7kJ⋅mol−1)。这一结果证实了二元酸-酰化反应可以提高Pg3G的热稳定性。此外，表1中的动力学参数表明，酰基的热稳定性与碳链长度呈正相关。这种现象可能归因于酰基的空间位阻，它影响花青素分子的水化并阻止降解。值得注意的是，Pg3G及其二羧酸酰化衍生物在强酸性条件下或中性条件下(图3)表现出相似的颜色特征，尽管它们在热稳定性上存在显著差异。这一现象表明，脂肪族二元酸-酰化反应对颜色特征的影响很小，因此，二元酸介导的酰化花青素可作为pH颜色指示剂的潜在应用。
图3
花青素的多态。花青素在水溶液中产生一种依赖于pH的多种状态，通常由flavylium cation (AH+), quinoidal base (A), hemiketal (B), cis-chalcone (Cc)和trans-chalcone(Ct)组成。这些物种通过几个可逆反应共享一个相互关联的平衡网络。一般情况下，在强酸性条件下，AH+是优势物种。但随着pH值的升高，AH+参与了不同的反应，并向其他物种转化。
第一步是质子转移形成A，在微秒内达到平衡。当pH≫pKa时，AH+立即完全转化为A，吸收光谱发生红移，最大吸收峰位于522nm。
第二步包括两个反应：水合生成B，然后互变异构化形成Cc。水合作用是一个限速步骤，因为它比互变异构化慢得多。
最后一步是指Cc经过异构化反应生成Ct，并在几小时内达到最终平衡。
Pg3G和Pg3G-二元酸衍生物的摩尔分数分布。摩尔分数分布只与氢离子浓度有关。PH<3时，AH+为主，pH>3时，以B和Cc为主(图4)。此外，当pH上升到7以上时，A将失去一个质子并转变为阴离子A−。然而，在强碱性条件下，花青素会自氧化并迅速降解。值得注意的是，在温和的酸性或中性条件下，二羧酸的酰化反应改变了AH+, A, B, Cc和Ct的平衡分布。来自酰化衍生物的Ct的摩尔分数比Pg3G的低得多(图4)。由于Ct的形成引发了花青素的降解，Ct的较少部分表明花青素具有较高的稳定性。这可能是酰化Pg3G衍生物在中性条件下表现出更好的热稳定性的主要原因。该研究结果表明，二元酸的酰化减少了不稳定的Ct的形成，这为研究酰化提高花青素稳定性的机制提供了一个新的视角。
图4
综上所述，天竺葵素-3-葡萄糖苷在6’’-羟基上被不同的二元酸酰化，推荐叔丁醇和叔戊醇作为Pg3G与脂肪族二元酸的酰化反应介质，转化率与二元酸的碳链长度呈正相关。对三个初级酰化产物进行了纯化和鉴定，证明了酶反应的区域选择性。酰化Pg3G衍生物具有更好的亲脂性和热稳定性。基于对Pg3G及其酰化Pg3G衍生物摩尔分数分布的分析，推测在弱酸性或中性条件下，二羧酸酰化反应改变了flavylium cation (AH+), quinoidal base (A), hemiketal (B), cis-chalcone (Cc)和trans-chalcone(Ct)的平衡分布，从而使酰化Pg3G衍生物表现出比Pg3G更好的热稳定性。总体而言，该研究为天竺葵素-3-葡萄糖苷与脂肪族二元酸的酶促酰化反应后的稳定性和亲脂性的改善提供了见解。
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文章信息：
PMID: 35500410
DOI: 10.1016/j.foodchem.2022.133077
