2022年12月23日08:14:12 科学 1132

麻辣烫不要麻酱

一导读

癌症的基因组分析极大地促进了驱动基因突变的识别和靶向治疗的发展。但肿瘤中大多数体细胞突变和拷贝数变异的功能仍不清楚，对靶向治疗产生耐药性的原因和解决耐药性的方法也缺乏明确的认识。现在基于质谱学的蛋白质组学可以直接检查出基因组异常的后果，为肿瘤学提供更深入的见解。蛋白质及其翻译后修饰与基因组、表观基因组和转录组数据的整合构成了蛋白质组学的新领域。下面的这篇综述描述了蛋白质组学的最新发展以及如何利用蛋白质组学研究癌症。

二背景知识

癌症蛋白质组学主要的内容是将基于质谱仪(MS)的蛋白质丰度测量和翻译后修饰(PTMs)与来自临床癌症模型和肿瘤样本的基因组、表观基因组和转录组数据相结合。癌症蛋白质组学中多组数据的分析给人们带来了新的生物学知识，提高了我们对恶性肿瘤和治疗的理解。基因组学和表观基因组学为可能发生的事情提供了细胞蓝图，而蛋白质组学则为已经发生的事情提供决策，因为蛋白质及其修饰是生物表型的最终仲裁者。

这些年来，有许多研究已经确定了驱动因子（EGFR、ERBB2(也称为HER2)、BCR-ABL、ALK和BRAF）会影响转移性乳腺癌、慢性粒细胞白血病、非小细胞肺癌和黑色素瘤等癌症的靶向治疗。然而，绝大多数体细胞突变是没有特定致癌功能的乘客突变。目前区分驱动和乘客突变仍然是一个难题，科研人员一般依赖于重复出现的统计数据来判断一个基因是否是驱动基因。但是，在单个肿瘤中，反复出现的点突变、小插入或小缺失的数量很少，那些不经常出现的突变基因不容易发现或不容易被药物治疗，这会限制了靶向治疗的发展。染色体拷贝数的扩增或缺失会影响多个基因，但目前对这些改变的后果知之甚少，也很难建立相关的模型。由于癌细胞有能力为细胞的生存和生长寻找替代途径，所以科研人员频繁的对靶向治疗的耐药性进行研究。最近，免疫肿瘤学方法认为癌症基因组和免疫系统之间的相互作用至关重要。蛋白质基因组学在这方面也提供了新的视角。

典型的蛋白质组学数据

蛋白质组学技术，主要基于液-质联用联用技术(LC-MS/MS)，广泛地应用于癌症研究。如下图所示显示了当前技术（临床数据；WGS，全基因组测序；WXS，全外显子组测序；甲基化芯片；RNA-seq，RNA测序；miRNA测序）测量的预期特征数量(拷贝数变异(CNA)、DNA甲基化)。通常，人们将来自肿瘤组织样本的数据与正常邻近组织(NAT)样本进行比较，在这一过程中，科研人员会利用各种数据类型进行分析。翻译后修饰(PTMs)数据是通过对富集样品进行深度LC-MS分析生成的，这样可以实现更高的检测灵敏度。现在对肿瘤样本的深层次分析通常使用多重的等压化学标记试剂（TMTPro，能够实现多达18个样本）。

最近还出现一种的微创方法：可以从单针穿刺活检中进行DNA、RNA和蛋白质组分析。科研人员使用新的样品制备方法，即在FFPE样品（组织样本利用福尔马林固定、石蜡包埋形成的石蜡切片或者石蜡块样本，是医学领域常见的生物材料）中完成全蛋白质组分析，但由于包埋过程本身的影响，PTMs分析仍存在局限性。此外，科研人员还在继续开发各种方法，比如FAIMS、SPS-MS3和实时数据分析，以提高蛋白质组测量的深度、准确性和重复性。最后，Data Independent Acquisition（DAI）已经开始应用于多组学和蛋白质基因组学研究，该技术可以减少蛋白质组数据中跨样本和数据集中的缺失值（图1）。

图1 典型的蛋白质组学数据

使用云计算模式分析蛋白质组的数据

云计算（Cloud computing）模式是人们按照自己的需求访问共享计算资源，这些资源可以快速配置以供使用，并且可以在数据分析后发表。随着科学家们的深入研究，数据集的规模越来越大，越来越多的算法被用于分析这些数据。云计算是分布式计算的一种，指的是通过网络“云”将巨大的数据计算处理程序分解成无数个小程序，然后，通过多部服务器组成的系统进行处理和分析这些小程序得到结果并返回给用户。云计算早期，简单地说，就是简单的分布式计算，解决任务分发，并进行计算结果的合并。因而，云计算又称为网格计算。通过这项技术，可以在很短的时间内（几秒钟）完成对数以万计的数据的处理，从而达到强大的网络服务。美国国立卫生研究院(NIH)数据共享计划是一项基于“云”的计划，旨共享基因组和蛋白质组数据。国家癌症研究所(NCI)基因组学云试点已经创建了基于云的共享计算环境。Terra 云平台可以快速分析海量的医疗数据。利用Terra的基础设施，科学家们已经开发了如PANOPLY这样的平台来自动分析蛋白质基因组数据。利用这些平台我们可以快速分析蛋白质基因组，从而提出相关的疾病假说，这些假说可以通过其他分析和实验室实验进一步探索（图2）。

图2 通过云计算进行蛋白质组数据分析

癌症中蛋白质组学格局

这些年来针对不同癌症类型，科研人员发表了一系列蛋白质基因组的研究。这些研究系统地整合并分析了基因组、转录组、全蛋白质组和PTMs数据，这样就可以进一步从生物学角度深入了解疾病的发病机制，并确定每种癌症类型的治疗靶点。总之，科研人员已建立了常用的统计方法来提炼癌症亚型，探索免疫微环境，推断新的抗原谱，探索DNA、RNA、蛋白质和PTM水平的协调调控作用以及蛋白质组或PTM特异性调控作用，最终可以确定癌症驱动因素和治疗靶点。以下是这些已发表的关于癌症的蛋白质基因组学研究 (表1)。

表1 蛋白质基因组研究的概念见解

蛋白质组学计算方法和工具

一般处理原始基因组数据的目的是为了识别体细胞和生殖系细胞的突变、量化拷贝数偏差和转录组分谱分析。所以计算工具一般需要具有的功能有：读取各种不同成分、质量控制、变体识别和RNA定。例如基因组分析工具包（GATK ，The Genome Analysis Toolkit）是由Broad Institute 开发的一套能发现多样性位点的工具集，它主要是为了分析DNA 测序和RNA 测序数据中的SNP（Single Nucleotide Polymorphisms）和indel（insert&delete）。现在科研人员最常用的是LC-MS/MS即液相色谱串联质谱技术，用于混合物的分离纯化和定性定量鉴定。分析原始LC-MS/MS蛋白质组数据可以产生定性和定量的蛋白质、磷酸化位点、乙酰位点和泛素化位点，这些分析工具有MS-GF+、Spectrum Mill、MaxQuant、MSFragger、Philosopher、CDAP。蛋白质组学中存在一个特殊的问题：由于多肽采样具有随机性、RNA-seq测量的动态范围有限性而导致的数据矩阵中出现更大程度的缺失值。这种现象在PTMs数据集中尤其明显。科研人员已经提出各种蛋白质组数据的imputation策略，想从计算方式上解决这一问题。例如DIA，可以缓解丢失数据的问题。下图中精选出了常用的蛋白质组学计算工具（图3）。

图3 蛋白质组学的分析工具

蛋白质组学相关的科研思路

蛋白质组学（Proteomics）是蛋白质与基因组学两个词的组合体，表示“一种基因组所表达的全套蛋白质”是一门以全面的蛋白质性质研究为基础，在蛋白质水平对疾病机理、细胞模式、功能联系等方面进行探索的科学。近年来，随着蛋白质组学技术突飞猛进的发展，已经应用于生命科学研究的各个方面。那么如何利用蛋白质组学技术进行科学研究。

①蛋白质组学确定新的潜在治疗靶点

科学家们发现早发型癌症的发病率，从1990年开始在世界范围内急剧上升，全球迫切需要开发治疗癌症的疗法。肿瘤已经成为了我们日常生活中的常见病，随着医学技术及科技的发展，临床对于恶性肿瘤的治疗，已经不再局限于手术、放疗、化疗三种手段来了，分子靶向治疗、免疫治疗等越来越多的新方法应用于临床，且效果很好，极大地提高了临床治疗肿瘤的成功率，延长了肿瘤患者的生命及生存质量。蛋白质组学分析，能够在高时间分辨率下确定转录组和蛋白质组的变化，加速确证致病性相关的生物途径以及寻找潜在的药物靶标。

下文的文章1对871名CLL（慢性淋巴细胞白血病）和MSBL（弥漫性大B细胞淋巴瘤）患者的384种总蛋白质和翻译后修饰蛋白质的表达进行了评估，并与临床数据相结合，目的是为了改进诊断和治疗的策略。这项研究是迄今为止规模最大的CLL蛋白质组学研究。该研究确定了复发癌症中的蛋白表达特征(SG)，对CLL进行了分类并确定了一个新的子集。这些特征对首次治疗的时间(TTFT)、总生存期(OS)有很强的预测作用。作者还发现了一种新的具有毛状细胞白血病样蛋白质组学特征但治疗反应差的SG。蛋白表达特征可以取代了其他预后 (如Rai分期、IGHV状态)，并且对现代治疗(如BTK抑制剂)的反应有预测作用。SGs和PFGs的加入为疾病提供了新的药物靶点，并确定了“Watch & Wait”（观察并等待策略是指患者通过接受密切随访、监测，避免或者延迟更为积极治疗的策略，而狭义上的观察等待限于新辅助治疗后是否进行手术）与早期干预的最佳候选标志物。总之，蛋白质组学在改善癌症分类、治疗策略选择和识别新的治疗靶点方面具有广阔的前景（图4）。

图4 CLL的潜在治疗靶点

②选择治疗和预后的生物标志物

生物标志物对于准确的临床评估至关重要，其中包括疾病诊断，预后和最佳治疗干预的选择。癌症是全球非传染性疾病死亡的第二大原因，目前大多数生物标志物研究都集中在癌症上。生物标志物不仅可以是分子特征，还可以是组织学、放射学或者生理学特征。常见的生物标志基于临床症状、体征、生理和实验室检测结果，其中组织学、放射学和磁共振成像生物标志依赖于医生的主观解释标志物组的检测准确性要远远高于某一个或某几个蛋白，越来越多研究的重点从单个生物标志物转移到生物标志物组，甚至与现有的临床指标进行整合。高通量蛋白质质谱技术基于临床样本产生的大数据集，可以作为重新挖掘生物标志物的丰富资源。

乳腺癌是女性最常见癌症之一，男性和女性都有可能罹患乳腺癌，但女性的发病率远远高于男性。尽管在乳腺癌的基因组分类方面取得了进展，显著地提高了诊疗水平，但目前的临床检验测试和治疗决策通常还是基于蛋白质水平的信息。下文2的作者对300 例确诊患者的临床存档的FFPE 乳腺癌手术标本（每种 PAM50 亚型中的 75 例）进行了全面的蛋白质组学分析，总共量化了 4214 种蛋白质，并以临床适用的方式表征了乳腺癌的异质性。研究人员发现了免疫差异、ECM 和脂质代谢通路可能与临床相关。在侵袭性 PAM50 分类的基底样癌中，蛋白质组学分析发现其中一组具有免疫“热”表达特征和最佳的生存期。在 88 例三阴性乳腺癌中，四个蛋白质组群显示出基底免疫“热”、基底免疫“冷”、间充质样和管腔样的特征，并具有不同的生存结果。蛋白质组学分析确定了潜在的生物标志物和治疗靶点：抗原提呈蛋白TAP1和HLADQA1的联合表达与患者生存相关，作者的研究还为临床乳腺癌分类提供了资源（图5）。

图5 FFPE乳腺癌组织标本的蛋白质组学分析

③用多组学方法重新定义和表征癌症亚型

现代肿瘤学认为肿瘤不再是一种疾病，而是一类疾病。对于同一种癌症类型（以癌灶器官命名）而言，由于肿瘤发病机制的复杂，在组织病理学及分子生物学上都具有高度异质性。

肿瘤通常是多基因参与的复杂疾病，不同阶段具有不同基因表达谱，癌症的遗传性、个体差异性和分子机制的复杂性，因此需要由基因群或基因簇来描述其特征。癌症亚型主要是通过临床、基因组或转录特征来定义的。多组学方法能够根据潜在的生物学和/或结果对亚型进行进一步的提炼或重新定义。癌症中这种更精细的亚型分型有助于我们定制治疗策略和评估疗效。比如是乳腺癌，具有lumA,lumB,basal,HER2 等亚型，其中TNBC（三阴性乳腺癌）可以继续细分为3~7种亚型，当然，现在有了蛋白质组学的加持，细胞亚型会越来越清晰。如果要整合多组学数据，分类也会更加复杂。

肺腺癌（LUAD）的基因组研究提高了我们对该疾病生物学和加速靶向治疗的理解。但是，LUAD的蛋白质组学特性仍然知之甚少。下面这篇文章3对103例中国患者的LUAD进行了全面的蛋白质组学分析。蛋白质组学，磷酸化蛋白质组学，转录组和全外显子组测序数据的综合分析显示了癌症相关的特征，例如肿瘤相关的蛋白质变体，独特的蛋白质组学特征以及早期患者或具有EGFR和TP53突变的患者的临床结局。基于蛋白质组的LUAD分层显示了与不同的临床和分子特征相关的三种亚型（S-I，S-II和S-III）。此外，作者提出了潜在的药物靶标并验证了HSP90β的血浆蛋白水平是LUAD的潜在预后生物标志物。这项研究的综合蛋白质组学分析可以更全面地了解LUAD的分子结构，并为更精确的诊断和治疗提供机会（图6）。