目前，实验室和临床最常使用的几种免疫检测方法中包括酶联免疫吸附法（Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay，简称 ELISA）和酶联免疫斑点法（Enzyme Linked Immunospot Assay，简称 ELISPOT），但这两种检测方法存在一定的局限性。例如，ELISA 和 ELISPOT 一次只能检测一个抗原或抗体靶标，而且无法检测低浓度的样品，检测灵敏度也不够高。
为改善以上两种检测技术的不足之处，苏州大学药学院药剂系刘密教授团队研发了 FOLISA 和 FOLISPOT 两种基于 DNA 条形码和 DNA 互补配对放大法的免疫检测新技术，实现了信号放大和同时多靶点检测。
图 | 刘密（来源：刘密）
该团队介绍，FOLISA 和 FOLISPOT 不仅能够同时检测多个抗原或抗体靶标，而且检测灵敏度远高于传统的 ELISA 和 ELISPOT，FOLISA 可以到达 fg 级别，检测到 ELISA 法无法检测到的信号，而 FOLISPOT 可以检测到 ELISPOT 法无法检测的仅分泌少量抗原的细胞。
近日，相关论文以《一种用于免疫吸附测定和免疫斑点测定的多目标同时检测方法》（A Multiple-Target Simultaneous Detection Method for Immunosorbent Assay and Immunospot Assay）为题，作为当期封面文章发表在 Analytical Chemistry 上，刘密担任通讯作者，苏州大学药学院药剂系 2021 届硕士生马建婷为共同一作[1]。
图 | 论文封面（来源：Analytical Chemistry）
据了解，ELISA 和 ELISPOT 一次只能检测一个靶标的主要原因是，这两种技术使用的是酶和底物信号放大法，一旦底物被酶催化显色后，同一个检测孔就无法再进行后续检测了。
而此次提出的免疫测定技术 FOLISA 和 FOLISPOT，在检测血清样本时能够进行多轮检测，每一轮可检测多个抗原。具体来说，FOLPISPOT 可以多轮检测分泌几种不同细胞因子的细胞，以分析各类型细胞同时分泌不同细胞因子的情况；FOLISPOT 可以用来检测仅分泌很少量细胞因子的细胞，如分泌 TGF-β 等细胞因子的细胞，且检测灵敏度远高于 ELISPOT。
研究人员表示，FOLISA 和 FOLISPOT 是通过 DNA 条形码和 DNA 互补配对法，检测抗体上连有特定 DNA 序列的 DNA 条形码，DNA 放大链和 DNA 检测链可以依次实现 DNA 互补配对以放大带检测靶标的信号。而且，这两种技术的检测灵敏度通过优化还可以进一步提高。
据悉，这两项技术中的信号放大系统是通过将 DNA 多联体与 DNA 偶联检测抗体连接来实现的，其中 DNA 多联体的长度与检测灵敏度有直接影响。通过调节反应参数能够改变 DNA 多联体的长度，从而控制整个检测系统的灵敏度。
值得一提的是，除了检测灵敏度，FOLISA 和 FOLIPSOT 的检测特异性和选择性也非常高。此外，通过研究人员的精巧设计，被检测后的信号可以在被依次洗脱后对同一样品进行多轮检测，这使得其在每轮检测中的检测靶标数量获得二次提升。
（来源：Analytical Chemistry）
研究中，由于 FOLISA 在测量单个靶蛋白方面表现出高灵敏度，该团队对这项技术展开了进一步的深入分析。他们使用具有单级信号放大系统的 FOLISPOT 检测了四种不同类型的靶蛋白，使⽤具有双级信号放大系统的 FOLISPOT 检测了六种不同类型的靶蛋白。
结果表明，与单级信号放大系统的 FOLISPOT 相比，具有双级信号放大系统的 FOLISPOT 检测灵敏度更高，可用于分析比强活化细胞分泌更少抗原的弱活化细胞。
此外，为验证 FOLISA 在实际应用中是否会受到血清中各种成分的干扰，该团队测量了血清中细胞因⼦的浓度，然后得出，使用 FOLISA 多途径同时检测人血清中六种细胞因子，与传统 ELISA 方法单独检测这六种细胞因子的效果没有显著差异。
图 | 使用 FOLISA 进行样品分析示意图（来源：Analytical Chemistry）
总体而言，无论是对于实验室样本检测还是潜在的临床样本检测来说，FOLISA 和 FOLSPOT 都为其快速、高灵敏度和多重检测的抗原或抗体提供了有效和通用的平台。而且，与现有技术 ELISA 和 ELISPOT 相比，这两项新技术不仅更灵敏、更高效，而且更节省人力和成本。
刘密表示，“我们相信，这种快速高效、多靶标、高灵敏度、高特异性的免疫检测技术，优于传统的 ELISA 和 ELISPOT 免疫测定技术，并有望在今后的实验室科研研究及临床免疫检测领域发挥重要作用。”
据了解，刘密主要专注于预防性和治疗性癌症疫苗、mRNA 疫苗递送技术和免疫多靶点检测技术等方面的研究，并拥有预防和治疗性癌症疫苗、mRNA 疫苗递送技术、免疫多靶点检测技术等国际专利和国内发明专利二十多项。
他是苏黎世瑞士联邦理工学院药学院药剂系的博士，还曾在哈佛大学医学院免疫系从事博士后研究。2018 年 12 月份加入苏州大学后，至今一直在该校药学院药剂系任特聘教授和博士生导师。
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参考：
1.Jianting Ma et al. A Multiple-Target Simultaneous Detection Method for Immunosorbent Assay and Immunospot Assay. Analytical Chemistry （2022）
https://doi.org/10.1021/acs.analchem.2c01087
