1 股骨头坏死病因：
股骨头坏死是局部血运不良，供给股骨头的动脉血液出现循环障碍，从而使得股骨头内需要的血液不足，进一步坏死，骨密度降低，股骨头容易发生塌陷的一种病变。最早的骨坏死相关报道是Alexander Munro在1738年发表的，直至1957年，有国外学者报道了第一例与激素相关的骨坏死。目前股骨头坏死的发生在任何年龄段都有可能出现，平均年龄低于50岁，大部分都是双侧坏死[4]。近些年激素类药物在临床上应用于各种急慢性疾病的治疗，如系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、脊髓损伤等，但是大剂量或长期使用激素类药物会导致一系列严重的并发症，如股骨头坏死、库欣综合征、诱发或加重感染等[5]。根据流行病学研究，非创伤股骨头坏死患者达812万，男性患病明显高于女性，北方患病率高于南方，城镇居民高于农村，激素在临床上广泛的使用势必会存在其潜在的危险，有学者表明激素性股骨头坏死已占据了非创伤性股骨头坏死的首位[6]。在中国非创伤性股骨头坏死主要病因是皮质类固醇药物的使用、长期酗酒、减压病、血红蛋白病；吸烟、怀孕、放射治疗也增加股骨头坏死风险[7]。
2 股骨头坏死的发病机制：
大多数医家对股骨头坏死的发病机制众说纷纭，到目前为止也尚不明确，有人认为股骨头坏死是有遗传易感性代谢因素和血液供应的局部因素(包括血管损伤、骨内压力增高和机械应力共同作用所致)，有研究报告称长期使用激素类药物导致股骨头坏死与药物持续的时间和剂量大小关系密切。主要是激素容易导致脂肪栓塞，并使得血液处于高凝状态，引起血管炎，激素导致的骨质疏松使得骨质的强度下降，承重力量消失，所以容易出现塌陷[8]。目前学者所认同的机制有骨质疏松、骨内压增高、血管内凝血等。由于患者长期使用激素，发生骨质疏松，易于受到压力出现骨小梁的细微骨折，由于累积的损伤较多，对机械抗力下降，从而出现塌陷，骨髓细胞和血管受压股骨头因缺血发生坏死。激素的使用能够使髓内脂肪体积增多，从而导致微血管脂肪栓塞和骨细胞脂肪沉积，骨髓细胞被大量脂肪细胞所占据，脂肪细胞融合成碎片造成骨髓衍生细胞死亡并且髓内腔空间压力增大，组织缺氧、水肿，血液渗出，加重微循环障碍，供养股骨头的血液减少，最终导致股骨头坏死。长期服用大量的激素，使得激素在人体内大量堆积，导致患者体内的血液变得黏稠，出现高凝血、低纤溶的状态，并且局部的凝血活性增高，形成微血栓局部血管闭塞，导致支配区域股骨头坏死[9]。
3 股骨头坏死骨组织病理学改变：
股骨头坏死动物模型制备从病理学角度分为早、中、晚3期(见表1)。而创伤性股骨头坏死在初期就出现动、静脉血运受阻，磁共振检查时可见明显改变[10]。
4 股骨头坏死影像学
在建立动物模型时影像学的检查方法必不可少，通过影像学检查等评价动物造模是否成功。目前检查方法主要有 X 射线平片、CT及MRI[11-12](见表2)。临床上针对股骨头坏死使用Ficat分期，主要分4期：1期有临床症状，磁共振可见信号强度改变，骨髓水肿；2期X射线片已有骨密度降低、囊性变、骨硬化等表现，但股骨头形态正常；3期可见股骨头塌陷，但关节间隙保持正常；4期可见关节间隙狭窄，髋臼出现异常改变。早期股骨头内部组织细胞形态尚未发生明显改变，故X射线片对股骨头缺血性坏死的早期诊断意义不大，晚期X射线片可见股骨头因塌陷失去原有球面结构，以及发生退行性关节炎的表现[12]。CT检查能够显示微细的松质骨和皮质骨的破坏，对于解剖结构或相互重叠的区域可明确其解剖关系及其异常，对于病变的内部结构的显示比普通X射线片更加准确。CT的密度分辨力优于X射线片，在一定程度可以区分不同性质的软组织。在显微CT分析中，在测骨矿物密度时具有明显优势，这也是预测骨折危险的依据。显微CT能够在任意方向测定骨三维结构，具有连续性和完整性的优势，还能够全面、立体、实时观察骨质量的改变，评价骨体积分数、骨小梁间隙等，因此显微CT的三维重建分析方法较传统方法更为全面[15]。
5 股骨头坏死动物模型选择
建立动物模型后是希望能够较完整地模拟出人类股骨头缺血性坏死从早期到晚期病理、生理改变并且坏死区域与人类股骨头缺血性坏死位置相似，目前主要还是使用一些比较成熟的建模方法，缺少一种理想的动物模型来高度模拟临床上股骨头缺血性坏死的病变过程，所以还需要不断完善和改进。目前作为常用的造模动物的选择四足动物有狗、兔、大鼠、猪；两足动物有鸡和鸸鹋[16]。
构建实验动物模型应该以临床现状为前提，从而做出满意的实验数据，首先选择实验动物的生理结构和组织学特点应该力求可靠地反映人类疾病，其在进化上应该与人类有良好的亲缘性及相似性，疾病在人类身上的进展过程在动物模型当中也需要体现，到晚期动物模型股骨头会出现塌陷变形，即股骨头骨坏死应该发生在关节软骨区域，还要保证股骨头的大小及结构应当与生物力学相联系，一般选用的大多都为四肢动物，所以在构建模型要考虑四肢负重的情况。王海洋等[17]采用股骨颈中部垂直截骨和螺钉内固定，选择影像学X射线片制备犬单侧股骨颈骨折内固定模型。巩建宝等[18]通过磁共振的精确定位，使用一种微创低温冷冻设备(氩氦刀)建立犬股骨头缺血性坏死模型，该方法具有创口小、坏死部分易于控制、动物死亡风险下降、造模成功率高、可重复操作性强、利于标准化研究等特点，为股骨头坏死的治疗方式医学发展提供了经验。顾江江等[19]采用酒精灼烧青脚麻鸡制备股骨头坏死模型，采用空心电钻在股骨头上钻孔，将酒精棉球填塞钻孔内，保证松质骨和酒精的充分接触，观察1个月X射线片显示关节面出现塌陷。曲春涛等[20]采用液氮冷冻3个循环之后采用射频加热制备鸸鹋股骨头坏死动物模型，除了2只死亡和4只感染，其余6周后可见股骨出现水肿现象，12周后股骨头形态明显改变及关节间隙改变，16周部分鸸鹋出现股骨头塌陷合并骨坏死晚期表现。
双足类动物特点是和人类的负重方式相似，选取该动物主要是研究股骨头缺血性坏死病程中生物力学因素。鸸鹋股骨头坏死模型是最好的动物股骨头坏死模型，虽然鸸鹋来源稀少，不好获取，喂养有难度，但是鸸鹋为一种双足负重，身高、体质量及股骨头受力情况均与人类类似的动物，股骨头应力分布与人类髋关节的测量数据相类似；且受力为沿股骨干的方向，均与人类相似，这种双足类动物与四足动物的髋关节生物力学的差异是造成不同股骨头是否塌陷的关键性因素[21]。实验中采用青脚麻鸡相较于其他除了具备易获得、容易饲养、死亡率低的特点，股骨头较大，方便手术和术后观察且为双足类动物，并长期处于站立位，股骨头受到的机械应力与人体的生物力学相似，能更好地模拟人在负重情况下的股骨头坏死和修复的表现。兔子是激素性股骨头坏死最常用的动物模型，虽然具备成本低、饲养简单等优点，而且股骨头相比大鼠来说更大一些，易于观察和取材；但是造模周期较长，成模率不高[22]。
犬为四足动物，虽然选用其造模，其生物力学承重区域与人类不相符合，不能完全模拟出人类股骨头坏死的特点，但它的解剖及组织结构与人类很相似，体型大小合适、来源获取方便，所以制备中应用最为广泛[23]，可用于股骨头缺血性坏死各种保头手术治疗，为后期造模成功后的治疗提供更理想的模型[24]。
6 股骨头坏死动物模型制备方法的选择
动物模型的制备方法有很多，主要分为创伤性和非创伤性，创伤性包括手术创伤造模、手术血运阻断法、化学损伤造模法、无水乙醇造模、液氮冷冻造模等；非创伤性主要包括单纯激素造模、激素联合脂多糖、激素联合马血清等方法[25-26]。
创伤是股骨头坏死的常见病因，有学者希望通过手术创伤造模来研究股骨头坏死。手术造模主要是使得股骨头的血液供应受到阻碍，供给股骨头的血液主要来源于旋股内外侧动脉、股骨头圆韧带动脉，股骨干滋养动脉[27]。旋股内侧动脉多于股三角处发于股深动脉，少数起始于股动脉，旋股内侧动脉从股深动脉发出后，走内侧于髂腰肌内侧缘处分为两支，深支较粗，行于耻骨肌与髂腰肌两条肌肉之间的后方，旁支供养附近的肌肉，终支于股方肌深面至转子窝，越过闭孔外肌，供应股骨颈基底部，延续为外侧颈升动脉。旋股外侧动脉大多也发于股深动脉，与旋股内侧动脉相比，起于股深动脉处下方，直径稍粗，向外侧走行，从缝匠肌和股直肌之间的肌间隙穿出，之后分为升降两支，升支向外侧走行于股外侧肌的深部，最后股骨颈的基底部的外侧面有一些细小分支，与旋股内侧动脉的分支共同构成囊外动脉环。囊外动脉环上又发出的分支分布到髋关节囊的关节囊支，之后进入骨内滋养股骨干，以及沿股骨颈上行营养股骨头、股骨颈的颈升动脉。由闭孔动脉发出的、小部分来自于旋股内侧动脉称为股骨头圆韧带动脉、股骨头骺内侧动脉。模拟临床上股骨颈骨折及脱位等原因引起的股骨头静脉淤滞、动脉血供受损及中断导致的骨坏死、股骨头结构发生改变。
6.1 股骨头韧带结扎 股骨颈骨折会影响髋关节的血运，造成周围的血管损伤，从而影响对股骨头的血供。一般发生骨折会伴随着移位，血流动力学发生改变，最终出现股骨头坏死。另外髋关节内的渗血或者出血，关节囊内压力进一步增高，股骨头内部结构造成了血液缺失，增加了肌肉组织通透性，水肿发生在局部，最终导致股骨头缺血性坏死[28]。王俊锋[29]采用股骨头韧带结扎观察兔股骨头结构的形态学变化，手术组在兔下腹部作垂直切口，将皮肤一层一层打开，从肌间隙拨开，打开髋关节囊，用手将股骨采用旋外位，结扎股骨头韧带，并使旋外时导致股骨头脱位后复位，之后缝合关节囊，将每一层肌肉、筋膜进行缝合；对照组只打开关节囊，将股骨头韧带找到，不进行结扎，直接关闭缝合关节囊，逐层缝合。术后4周在光镜下检查骨形态发生蛋白7 在软骨下的肥大软骨细胞的表达呈现明显增强的现象，这说明在结扎后，股骨头韧带周围的关节面血液受到阻碍，发生改变；软骨关节面的软骨细胞及软骨下细胞生长增殖受到抑制，甚至发生坏死；骨形态发生蛋白7 的表达增强，表明其对软骨细胞发挥积极的修复作用。通过结扎的方法成功制备了动物模型，这对临床上创伤性股骨头缺血性坏死的治疗研究有一定帮助。
6.2 酒精造模 主要是通过在股骨头局部注射无水乙醇，导致股骨头缺血性坏死，进而坏死骨质吸收，骨小梁强度下降，髋关节持续生物压力阻碍骨坏死后的修复作用，引起骨小梁力学强度进一步下降，使动物模型容易进展至股骨头塌陷。该类动物模型常用于股骨头缺血性坏死治疗方法的研究。自 1922 年 Axhausen 报道乙醇中毒患者易患骨坏死疾病以来，人们一直在探讨研究酒精和股骨头坏死发病之间的关系，研究其机制、病理过程等。在非创伤性股骨头坏死的致病因素当中，酒精导致的股骨头坏死是仅次于激素相关的第二大因素，长期饮酒导致股骨头坏死病例在临床中十分多见并且好发于聚会比较的多的中青年人，一旦发病，双侧股骨头均有症状且影像学也有变化，病变发展到3期至4期股骨头表面结构出现变形塌陷及不可逆性骨性关节炎，患者的生活自理能力失去，最后只能采用人工髋关节置换手术治疗。杨云等[30]采用乙醇制备酒精性股骨头坏死大鼠模型，实验中除有6只大鼠死亡，余下良好，观察4个月股骨头软骨出现颜色晦暗，失去原有的润泽，部分血管弹力纤维减少，弹性纤维增生，微血栓数量增加；6个月后出现股骨头表面结构出现破坏，甚至脱落，骨质量下降，未见股骨头明显变形塌陷及髋臼磨损改变。针对大鼠四肢负重，后肢的负重量小，所以将食物及水放到高处以便大鼠进食水时会增加双下肢承重量，这种方式的采用会更加近似人类的生物力学特性。因此研究酒精性股骨头坏死发病机制需要考虑多种因素对其实验过程中造成的影响，在造模过程中借鉴生物力学原理，使坏死程度发展与人类股骨头发生病理现象类似，这将是未来股骨头坏死动物模型研究的主要发展方向[31]。
6.3 液氮冷冻法 相对来说是应用比较多的一种造模方法，该方法建模周期短、成功率高、可重复性好。从髋关节后外侧切口充分暴露施术部位，切断股骨头内的圆韧带，并用三层无菌纱布保护周围组织防止损伤，然后将液氮浸泡在股骨头当中，冷冻一次复温数次，这种操作对股骨头局部进行液氮冷冻之后，骨内周围组织细胞温度迅速下降而出现休克，引起股骨头内部分血管发生痉挛，毛细血管内皮细胞水分丢失，细胞皱缩，微血栓形成，另外冷冻后可引起毛细血管通透性增加，导致血液黏稠度增加，血流速度缓慢。造模采用液氮低温冷冻一次复温数次循环，可以使其骨内部分细胞、骨内细胞结构蛋白质和细胞骨架蛋白破坏，进一步阻断了 DNA复制，使得股骨头内部活性成分出现坏死。周正丽[32]采用液氮制备兔股骨头坏死模型，在无菌条件下进行，以双侧大转子为连线，做一弧形皮肤横切口，剥离浅筋膜和深筋膜，充分暴露肌肉组织，切断股骨头圆韧带，使股骨头处于全脱位状态，暴露股骨头关节面，固定橡皮漏斗，液氮冷冻股骨头，术后4周关节面才出现不完整，开始剥脱，术后6周有缺损，观察8周后股骨头出现明显塌陷。该方法是目前这些造模方法中最有效、成功率最高的导致股骨头坏死的方法；并且采用液氮冷冻能够更好地模拟人类股骨头坏死病理生理过程中坏死区域的骨修复，实验的可重复性很高，能够控制其冷冻的范围和时间，是一种方便可操控的标准化动物模型。
6.4 激素造模 成骨分化与成脂分化之间的不平衡是激素性股骨头坏死的主要原因。有研究发现类固醇激素能够降低Ⅰ型胶原及骨钙素 mRNA 的表达，骨髓遭脂质代谢紊乱的侵袭，使得骨祖细胞死亡加快，损伤修复缓慢[33]。长期大剂量服用激素类药物，会引起血脂增高、血液流速缓慢，容易全身形成脂肪栓塞，供应股骨头的血液来源局部出现血瘀，股骨头坏死脂肪细胞的形成会造成骨髓造血细胞的死亡，最终导致股骨头坏死。长期大剂量使用激素会导致患者体内脂代谢紊乱、血液黏稠度增高、骨细胞脂肪蓄积及脂肪变性，这些原因使得血液流速减慢，通往骨细胞的血液量减少甚至出现血液凝固，骨髓腔受到压力，股骨头中的微小血管出现阻塞现象，最终导致缺血性骨坏死。糖皮质激素的使用会直接降低蛋白质的合成，阻碍机体对钙的吸收，大量钙流失，骨质量明显降低，出现骨质疏松。另一方面成年人的成骨细胞修复机体的速度大致和破骨细胞相一致，大剂量的糖皮质激素使得成骨细胞修复速度减慢，减少骨转换，骨质量下降，容易导致股骨头的承重部分出现塌陷，甚至坏死[34]。服用糖皮质激素后，成骨细胞和骨细胞最易受到侵害，骨细胞的凋亡会使骨密度降低、骨小梁紊乱，此时受到外伤情况股骨头部位发生骨折，最后股骨头缺血性坏死形成。佟鹏等[35]根据现代研究构建的动物模型方法采用醋酸泼尼松龙联合马血清建立动物模型，实验当中考虑人类生物力学的特性，给兔子饮水采用悬吊法，保持下肢直立，结果有8只兔子造模成功，软骨结构改变，软骨塌陷严重。
综上，通过手术方式建立股骨头坏死模型存在一定的弊端，手术创面大、对动物组织损伤大、死亡率较高、病理改变与人类病理过程有差别。乙醇制备股骨头坏死，造模成功率低下，乙醇的用量和造模过程能否精准的作用于股骨头，难以进展到后期。液氮冷冻造模操作时对其他组织破坏程度难以把握，冷冻范围不能确定，另外动物的恢复能力强，能否成功造模还是未知数；其致病因素与人类股骨头坏死无相关性，不太适合于对股骨头坏死病因、发生机制和特征的研究。相比较其他而言，激素制备创伤小、方便操作，对股骨头坏死病理过程的研究更加适合，并且激素联合马血清、激素联合脂多糖造模成功率更高[36]。
近年来因为激素的使用而发生的股骨头坏死率增高，所以探索一种贴近人类股骨头坏死病理变化的动物模型为临床提供有效的治疗手段必不可少。由于激素在动物和人体中有相似的作用机制[37]，于是人们开始采用激素制备动物模型。目前关于激素性股骨头坏死动物造模的方法有很多，例如单纯使用激素法、激素联合马血清法、激素联合内毒素法等，进行实验给予动物的药物剂量和方式有所不同。
(1)单纯激素诱导：刘伟等[38]单纯应用低剂量激素制备兔股骨头坏死模型，采用直立进食水方式增加股骨头负重，根据组织病理学检查将甲泼尼龙琥珀酸钠肌肉注射，给药后4周脂肪细胞体积增大，胞核消失，部分崩解破裂，骨髓干细胞相对减少。6周可见骨小梁内的空骨陷窝数量逐渐增多。8周可见部分股骨头软骨区形成坏死，并可见坏死和软骨面塌陷，虽然出现1只兔子死亡，但建模方式比较安全，可以保证实验最终的样本例数。该方法成功率高、病理变化符合、成本低、操作方便，避免不必要的因素影响，有利于临床医学股骨头坏死的病机探索研究。
(2)激素联合马血清诱导：曹良权等[39]采用不同剂量的马血清和激素制备兔股骨头坏死，分成4组，采用磁共振及进行观察，其中有2只死亡。高剂量组在第2周就出现异常信号，在第4周表现为斑片状或是小结节状高信号影，在第6周高剂量组80%出现骨坏死信号；其余组出现骨坏死的比率均低，组织病理学，空骨陷窝程度在高剂量地塞米松联合高剂量马血清组逐渐增加，一些骨小梁已破损不完整。糖皮质激素已被认为是非创伤性股骨头坏死的最常见原因。该实验调整马血清和激素注射的剂量和时间，从而避免因注射过量及间隔时间过短而引起过度的免疫反应致动物死亡，且具有较高的成功率和类似的安全性；采用血液学进行评估观察30 d检测模兔子的血清胆固醇和三酰甘油水平，各组均增高，尤其高剂量组血清胆固醇水平明显升高。
(3)激素联合脂多糖诱导：采用激素联合脂多糖造模，具备造模时间减少、动物死亡风险降低、造模成功率高的优点，因此，多用于股骨头坏死病理机制方面的研究。喻钧伦等[40]以螺旋CT扫描、Micro-CT扫描、苏木精-伊红染色方法观察兔股骨头形态及骨质密度等影像学表现，观察骨小梁的形态、分布、骨皮质厚度，并测定骨矿物质密度等，分别在建模后第5，10，15，20天观察股骨头内部结构及密度改变，其余形态未发生变化。显微CT表明骨小梁紊乱，骨质量下降，股骨头可见细小微型骨折。病理学检查骨细胞凋亡增多，骨质量丢失增加，承重力量消失，骨修复出现障碍。田力等[15]使用地塞米松联合脂多糖制备股骨头坏死，采用螺旋CT、显微CT、组织形态学检查，将股骨头坏死兔和正常兔对比，螺旋CT示：骨密度不均一，关节面模糊；显微CT示：骨矿物质含量及骨小梁密度均降低；组织形态学示：髓腔内造血细胞明显减少，软骨下骨微小血管内可见血栓形成。实验当中使用了CT、显微CT扫描和病理学检查来评价早期股骨头缺血性坏死，3种方法相互补充，相互联系，诊断明确，具有客观性，CT扫描方便快捷，能够观察股骨头不同横断面密度的变化，判断是否造模成功。
综上所述，没有一个动物模型能和人类疾病发生的病理机制相同，动物模型的制备时间、制模成功率、制模成本均对实验有影响。不同的动物在不同的模型建立上有各自的优势，物理方法造模虽然能降低造模死亡率、造模周期短，但不符合临床的疾病的病理过程；化学方法造模容易在动物体内残留化学物质，对后期研究影响较大[42]。激素性股骨头坏死动物模型在病因学上具有与临床股骨头坏死患者贴近，是目前常用的建模方法之一，该方法不需要手术，操作简单，但也存在一些问题，激素的种类包括很多，每种激素的对其产生的影响，作用靶点是否一致，另外激素的使用剂量、使用次数、产生作用的时间以及作用部位能否集中在股骨头上，仍需要进一步探讨和研究。相信随着社会发展，研究的不断深入，更好的动物模型将会建立，这也是未来几年国内外学者共同追求的目标和前进的方向。
信息来源：中国组织工程研究，2021，25(29):4691-4696.
