點評 | 李國紅 研究員（中科院生物物理所）
責編 | 酶美
作為基因表達調控的核心，轉錄起始過程發生在基因啟動子區，通過染色質重塑複合物剔除核小體暴露出啟動子, 允許轉錄起始複合物（preinitiation complex，PIC）的組裝， 在中介體（Mediator）的幫助下組裝成PIC-Mediator轉錄起始超級複合物。徐彥輝團隊圍繞人源轉錄起始機制研究取得了系列重要突破，部分成果入選2021年度中國生命科學十大進展。
PIC-Mediator是轉錄起始調控的核心，基因表達主要受轉錄因子和表觀遺傳調控。其中轉錄因子結合在增強子和啟動子附近促進PIC-Mediator的招募和組裝，而表觀遺傳對轉錄的調控集中在啟動子下游的第一個核小體上（稱為+1核小體）。與其他核小體不同，+1核小體含有組蛋白乙醯化和H3K4三甲基化修飾，特徵性的組蛋白變體H2A.Z和H3.3。這些特徵的形成受修飾酶和染色質重塑複合物動態調節，影響所在基因的表達水平，是表觀遺傳調控的核心。目前絕大部分模型顯示轉錄複合物與+1核小體是分離的，+1核小體中組蛋白的柔性末端修飾可結合TFIID幫助PIC招募，同時轉錄機器進入延伸狀態才遇到並繞過+1核小體。以往所有轉錄起始複合物結構都是基於DNA模板，無法展示+1核小體與轉錄起始複合物之間的結構功能關聯性。
2022年10月7日，復旦大學生物醫學研究院/復旦大學附屬腫瘤醫院徐彥輝課題組在Science雜誌上在線發表題為 「Structures of +1 nucleosome–bound PIC-Mediator complex 」的研究論文。該項研究解析了包含+1核小體的PIC-Mediator複合物結構，首次展示了轉錄起始複合物與+1核小體的緊密結合，表明+1核小體對轉錄起始複合物在染色質上組裝的重要調控作用（圖1），建立了表觀遺傳和轉錄起始的直接關聯。
圖1：結合+1核小體的PIC-Mediator結構
以往的測序研究表明，多數+1核小體位於基因轉錄起始位點（TSS）下游約40 bp處。受這一現象啟發，研究團隊構建了包含核小體和啟動子的模板，根據核小體與TSS之間的距離，命名為T40N（T代表TSS，N代表核小體，數字代表距離），T50N，和T70N。利用體外重構方法，成功組裝了分別結合三種+1核小體的PIC-Mediator轉錄起始超級複合物（84個蛋白，分子量4.3MD），通過結構和生化分析，發現+1核小體與PIC-Mediator複合物存在多處直接相互作用及多種作用方式，通過結合 TFIIH和Mediator多個亞基，促進PIC-Mediator在染色質上的組裝和轉錄起始活性。
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+1核小體與PIC-Mediator的結合還表現出與功能密切關聯的如下特點：
核小體位置的偏好性（圖2）。PIC-Mediator更傾向於結合T40N核小體，形成較為穩定的相互作用。也可以結合T50N核小體，這時候會有一部分核小體趨向於解離，原因是核小體與複合物距離增加，結合要造成DNA的彎折產生張力部分抵消結合的吸引力。而到了T70N核小體，直接接觸就沒有了。體外轉錄起始活性實驗顯示，T40N核小體可以增強轉錄活性，而T70N則沒有。這些結果不僅很好的解釋了體內測序的結果（+1核小體與TSS距離40bp左右），也提示了其產生背後的原因。也就是說，PIC-Mediator複合物要整合啟動子上的序列信息與核小體的位置信息，決定其結合位點和轉錄起始位點。人體中大部分啟動子不含有TATA box這樣的強定位序列，PIC-Mediator是以+1核小體為主要的參考點，產生適宜的結合方式，這種結合的位置決定了轉錄起始位點。
圖2. PIC-Mediator與三種不同定位核小體的結構。A. T40N, T50N和T70N三種啟動子模板的模式圖。B，C，D. 結合T40N，T50N，T70N的PIC-Mediator複合物結構。E. T50N核小體（黃色）的四種不同結合狀態。
相互作用的包容性。核小體與PIC-Mediator通過靜電相互作用結合，沒有明顯的序列特異性。比如TFIIH和Mediator亞基的鹼性區，在整體複合物的框架下，結合核小體DNA的酸性骨架和H2A.Z-H2B的酸性表面。這種結合的特點是特異性低，只要電荷相反，位置臨近，就有吸引力。因此包容度高，可以允許一定程度的構象變化及核小體的位置變化，使得轉錄機器能夠結合到各種不同啟動子的核小體上。
目前主流觀念認為，轉錄機器在進入到延伸階段才會碰到核小體，該項工作首次在分子水平上展示出了轉錄起始複合物與+1核小體的緊密結合，將轉錄起始位點附近的表觀遺傳信號和轉錄起始建立了直接關聯。從轉錄起始位點到+1核小體之間的幾十個核苷酸範圍內（約14納米），發生的一系列轉錄起始事件（RNA合成，聚合酶前移，暫停，釋放，加帽，延伸等），數十種不同轉錄調控複合物（上百種蛋白）的動態解離和結合，都需要考慮+1核小體及其表觀遺傳調控的影響（圖3）。這一研究將改變我們對轉錄起始過程和以+1核小體為代表的染色質相互關係的傳統看法，為研究表觀遺傳和基因表達調控提供新的指導框架和結構基礎。
圖3. +1核小體在轉錄起始到轉錄早期延伸系列動態過程中都可能發揮作用。。從TSS到+1核小體為40bp左右，約為14nm，在這個範圍內會發生一系列轉錄早期事件，也是基因表達調控的核心區域。
復旦大學生命科學學院青年研究員陳曦子、復旦大學生物醫學研究院2020級博士生王鑫鑫、2019級直博生劉維達為本文共同第一作者，徐彥輝為通訊作者。
專家點評
李國紅 研究員（中科院生物物理所）
在真核生物中，基因轉錄的精準調控在許多重要生物學過程中發揮至關重要的作用。基因轉錄包括轉錄起始、轉錄延伸和轉錄終止三個過程，其中轉錄起始是基因轉錄調控的核心，轉錄起始過程發生在基因啟動子區。我們知道，真核生物中，基因組DNA纏繞組蛋白八聚體形成核小體，在連接組蛋白H1和其他染色質架構蛋白的作用下形成各種染色質高級結構。因此，啟動子區域的染色質結構在基因轉錄起始過程中發揮重要的調控作用。前期各種生物化學和基因組學實驗發現基因啟動子區域的核小體定位和染色質結構具有非常鮮明的特徵，比如啟動子區域核小體被剔除或移位，形成一個開放的染色質區域，這樣轉錄機器可以招募到啟動子區域，並組裝形成轉錄起始複合物。另外，非常有趣的是，在大多數基因的啟動子區域，轉錄起始位點下游的第一個核小體（稱為+1核小體）定位非常有規律，一般位於基因轉錄起始位點（TSS）下游約40 bp處。並且，表觀遺傳組學研究發現，在高表達基因的+1核小體上富含各種重要的組蛋白化學修飾（比如H3K4me3和組蛋白乙醯化）和特異的組蛋白變體（H2A.Z和H3.3）。現在領域內對於+1核小體及其表觀遺傳特徵在轉錄起始調控中的功能仍然不是很清楚，比如轉錄起始複合物與+1核小體的相互作用及其表觀遺傳調控機制等。近年來，隨著冷凍電鏡技術的發展，徐彥輝和Patrick Cramer等團隊在轉錄起始複合物（PIC）和PIC-Mediator轉錄起始超級複合物的招募與組裝方面取得了一系列重要的突破性進展和成果。但是，上述所有轉錄起始複合物結構都是基於裸露DNA模板，無法展示+1核小體與轉錄起始複合物之間的結構功能關聯性。
徐彥輝團隊今天在Science上發表的這項工作，正是回答了上述關鍵問題。該項研究解析了包含+1核小體的PIC-Mediator複合物結構，首次展示了轉錄起始複合物與+1核小體的緊密結合，表明+1核小體對轉錄起始複合物在染色質上組裝的重要調控作用，建立了表觀遺傳和轉錄起始的直接關聯。該項工作實驗體系複雜，難度非常大，實驗設計非常巧妙，研究思路非常新穎。
1）研究團隊為了證明+1核小體定位的重要功能，通過改變+1核小體與TSS之間的距離（40 bp, 50 bp 和70 bp），設計和構建了三個不同DNA模板，這個實驗設計很巧妙，可以回答為什麼一般+1核小體定位在TSS下游40 bp處。該研究結果顯示，+1核小體與PIC-Mediator的結合具有兩個顯著的特徵：核小體位置的偏好性（～40 bp）和相互作用的包容性，很好解釋了PIC-Mediator複合物怎樣通過整合啟動子上的序列信息與核小體的位置信息，決定其結合位點和轉錄起始位點，精準調控各種不同基因的轉錄起始。
2）利用體外重構方法，研究團隊成功組裝了分別結合三種+1核小體的PIC-Mediator轉錄起始超級複合物（84個蛋白，分子量4.3MD），並解析了它們的冷凍電鏡結構。這個體系非常複雜，涉及蛋白質種類多（包含近百個蛋白質），結構形式高度動態，難度非常大。我本人在Danny Reinberg實驗室做博士後期間做過類似的工作，我們利用體外轉錄體系，研究RNA Pol II在30-nm染色質纖維上的轉錄過程，深知這個體外重構體系的難度和不容易。幾年前，在施揚老師、石雨江老師和藍斐老師組織的表觀遺傳學retreat中，徐彥輝老師與本人有過深入交流，當時我對利用冷凍電鏡解析轉錄起始複合物和轉錄延伸過程的調控機制還持懷疑態度。最近，徐彥輝團隊和德國馬普所Patrick Cramer以及日本東京大學Hitoshi Kurumizaka等團隊（兩篇Science丨RNA聚合酶II如何轉錄延伸通過核小體？；Science | 真核基因轉錄延伸複合體穿過核小體的分子機制）在轉錄起始複合物招募與組裝以及RNA Pol II在核小體上轉錄延伸調控機制上取得了一系列突破性進展。本人對徐彥輝老師團隊取得的進展和成果表示祝賀，也對完成這些工作的學生和工作人員表示敬佩，同時對我們自己研究工作也是一種極大的鼓勵。
3）在該項研究中，徐彥輝研究團隊在+1核小體構建了組蛋白變體H2A.Z核小體。在大多數高表達或可誘導基因的啟動子下游+1核小體富含組蛋白變體H2A.Z，但是現在大家對H2A.Z核小體的生物學功能還有不少爭議。徐彥輝團隊的該項工作顯示，TFIIH和Mediator亞基的鹼性區可以與核小體DNA的酸性骨架和H2A.Z-H2B的酸性區域結合，H2A.Z核小體的酸性區域比常規核小體的酸性區域更酸，所以PIC-Mediator複合物與H2A.Z核小體的作用更強，這也許對調節轉錄起始複合物與+1核小體的功能互作具有重要意義。最近Patrick Cramer和Hitoshi Kurumizaka（Science | 真核基因轉錄延伸複合體穿過核小體的分子機制）兩個團隊利用冷凍電鏡，解析了RNA Pol II轉錄延伸複合體（包含轉錄延伸因子DSIF（Spt4/5）、Spt6、PAF1、FACT (Spt16/SSRP1)和TFIIS）在核小體上進行轉錄延伸機制，捕獲到延伸複合體在核小體DNA上前進的細節，發現延伸複合體可介導下游核小體解聚並在上游重新組裝，其中組蛋白伴侶FACT或Spt6促進該過程，從而維持轉錄過程中核小體的完整性，這也驗證我們研究團隊幾年前FACT-核小體單分子磁鑷操縱的研究結果（Mol Cell丨李國紅組揭示組蛋白伴侶對核小體結構調控的分子機制）。值得一提的是，上述兩個團隊都是用常規H2A核小體來研究轉錄延伸機制，但是在大多數基因的+1核小體是H2A.Z核小體，未來利用冷凍電鏡和單分子技術研究轉錄延伸複合物通過含有H2A.Z的+1核小體的結構細節和動力學過程將會更有生理學意義。
綜述所述，徐彥輝團隊的這項工作實驗設計巧妙，實驗體系複雜，難度大，內容豐富，研究思路新穎，結構非常漂亮。該項研究不僅改變了我們對轉錄起始過程和以+1核小體為代表的染色質相互關係的傳統看法，還為未來研究轉錄起始過程中從轉錄起始位點到+1核小體之間發生的一系列轉錄起始事件（RNA合成，聚合酶前移，轉錄停滯與釋放，RNA加帽和轉錄延伸等）的表觀遺傳調控機制提供了研究體系和指導框架。在此，再次祝賀徐彥輝團隊在轉錄起始調控機制研究方向上取得又一重要進展，期待他們團隊在後續研究中取得更多的突破。
原文鏈接：
http://doi.org/10.1126/science.abn8131
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