文 ｜ 《中國科學報》記者 刁雯蕙
在嬰兒呱呱墜地之前，受精卵是如何發育成複雜個體的？為什麼正常的細胞會慢慢變成癌細胞？
細胞是生命的基本單位，了解它的過去、現在和未來不僅有助於人們了解正常發育的過程，也對理解疾病的產生和發展至關重要。
然而，「看清」細胞的「前世今生」仍然存在顯著的技術困難。
8月17日，中國科學院深圳先進技術研究院合成生物學研究所研究員陳萬澤作為共同第一作者在《自然》發表長文，介紹了研究團隊在國際首創的活細胞轉錄組測序技術（Live-seq）。
該技術首次讓單細胞進行轉錄測序後依然能保持細胞存活，實現了活細胞全基因表達的連續觀測。
「該研究實現了使用Live-seq技術對同一個活細胞多次分離部分細胞質進行多次轉錄組測序的可行性，表明這一技術有望在將來用於構建單個活細胞的轉錄組系列變化動態。該研究為單細胞轉錄組測序提供了全新的研究策略，為我們理解生命過程的動態變化提供了強有力的手段，是這一領域的又一重大突破。」北京大學生命科學學院教授湯富酬評論道。
活細胞測序記錄細胞變化示意圖。 圖片來源：Duygu Koldere Vilain
不殺死細胞就能測序
人體內的細胞擁有幾乎一樣的基因組，但是為什麼能夠產生多種多樣的細胞？基因組中數萬個基因的表達與否和表達量的高低，很大程度上決定了細胞的種類和功能，比如神經細胞、免疫細胞、各種腫瘤細胞等。
如果知道細胞不同時間的基因表達的變化，就能夠了解細胞的過去、現在和未來。
當前，單細胞轉錄組測序技術是了解細胞狀態的重要手段。
就像看一張「高清照片」，通過單細胞測序能夠看清細胞現在所有基因的表達狀態。
但是，這些技術在理解細胞狀態「電影」般的動態變化上卻面臨很大的挑戰。
「利用單細胞轉錄組測序技術觀測細胞狀態的前提是將細胞裂解，提取其中的RNA來測定每個基因表達量的高低，這樣就不可避免地殺死了細胞。」陳萬澤說，「此外，使用單細胞測序技術也只能了解到一個細胞當下的狀態，卻不能獲得它的過去，也無法知曉它將來的功能。」
通過近7年的努力，陳萬澤與合作者開發了活細胞轉錄組測序技術Live-seq，其核心是通過對活細胞中的部分細胞質進行微創提取，並對極其微量的細胞質RNA進行擴增，在單細胞轉錄組測序後依舊保持細胞的存活和功能，從而實現細胞動態變化的跟蹤。
論文通訊作者、瑞士洛桑聯邦理工學院教授Bart Deplancke表示，該技術兼具全基因表達解析度和動態解析能力，是目前對單細胞轉錄組直接動態測量、偶聯細胞現有狀態及其後續表型的唯一解決方案。
兩次碰壁，終於「釣」出RNA
如何在不殺死細胞的前提下看到細胞的動態變化？
「我們首先想到的是外泌體，它是細胞向外面吐出來的小泡，裡面有蛋白、RNA等物質。如果我們把單個細胞的外泌體都收集起來，再對其中的RNA進行測量，或許就可以在一定程度上反映細胞狀態而又不殺死細胞。」陳萬澤說。
單個細胞中僅有10皮克RNA，相當於1克的一千億分之一，而細胞外泌體中的RNA更是少之又少。
研究團隊設計了微流控晶元來完成單細胞捕獲、外泌體收集等過程，發現由於外泌體中的RNA數量太少，根本無法實現單細胞分子水平的觀測。
隨後，陳萬澤嘗試利用在生命科學領域非常小眾的原子力顯微鏡——它有一個很尖的硅探針，多用來檢測物質表面性質。
研究團隊對探針進行表面活化、修飾、洗脫等改造後，讓其能夠把細胞中的RNA「釣」出來。
「這種探針很細，對細胞的損傷很小，就像『魚鉤』一樣，改造後可以把細胞中的RNA『釣』出來，又能保證細胞繼續存活。我們改造了數十個探針後，結果只在兩個細胞上成功『釣』到了基因。」陳萬澤回憶道，當時購買一個原子力顯微鏡探針需要800美元，研究成本太高，成功率太低，讓這項研究再次受阻。
瑞士洛桑聯邦理工學院學科交叉氛圍濃厚。
在一次偶然的學術交流中，陳萬澤與導師了解到，瑞士蘇黎世聯邦理工學院的Julia Vorholt實驗室開發了一種特殊的原子力顯微鏡，能夠吸出一部分細胞質。
一番交流後，兩個課題組一拍即合，展開了聯合攻關。聯合團隊對一系列實驗過程進行了優化，解決了RNA降解、低溫下的快速操作、超微量樣品轉移、採樣通道清洗避免交叉污染、圖像下追蹤細胞等多種問題，以保證實驗結果的可靠性。
聯合團隊利用重新改造後的Live-seq，對5種類型共295個細胞進行了測序，發現Live-seq能夠有效區分不同類型的細胞，且平均每個細胞能檢測到約4112個基因的表達信息。
僅對少量的細胞質進行測序，是否就能代表細胞的狀態？「我們平行比較了單細胞測序結果，發現活細胞測序結果與普通的單細胞測序結果高度吻合，證明Live-seq能夠很好地體現細胞的全轉錄組狀態。」陳萬澤說。
細胞的存活率又如何保證呢？
「原子力探針尖端只有幾百個納米大小，而且能和細胞膜密封，對細胞損傷極小。吸取約5%至50%的細胞質後，細胞體積可以快速恢復到正常水平，存活率在85%至89%之間，細胞能進行正常分裂。通過一系列的功能分析和分子表徵，我們沒有發現Live-seq對細胞狀態有顯著影響。」陳萬澤表示。
對此，審稿人在評審意見中也寫道：「由於細胞測序後仍舊存活，Live-seq首次實現對同一個細胞全基因表達的連續測量。」
細胞測序史從「高清圖片」
到「高清電影」的跨越
在細胞觀測技術史上，顯微成像和基因編輯介導的分子記錄等技術不僅能觀察細胞水平的生長、分裂、死亡等過程，還能觀測細胞中的單個或幾個基因指標。
2009年，單細胞轉錄組測序技術為更系統、全面地定義細胞類型和狀態提供了變革性手段。
但人們仍然只能觀察到細胞的靜態狀態，無法連續觀測細胞動態或者檢查細胞後續的表型。
如果把利用單細胞轉錄組測序技術觀測細胞比喻為看一張細胞在分子水平的高清圖片，那麼利用Live-seq觀測細胞就好比看一部高清電影，能夠看見細胞的「前世今生」。
「Live-seq可以回答細胞的過去怎樣決定它的現在，不僅知道細胞中為何存在差異，還知道這些差異從何而來。」陳萬澤介紹道。
在驗證實驗中，團隊利用Live-seq直接測定了同一個巨噬細胞在不同時間的狀態變化，發現細胞起始狀態的少數基因的表達差異和雜訊（如Nfkbia、Gsn等）是決定細胞後續反應差異的重要原因。
相對而言，普通的單細胞轉錄組無法找到這些規律。
陳萬澤表示，儘管Live-seq仍然存在諸多挑戰，需要進一步完善，比如低通量、暫不能在體內應用、在高度極化且mRNA分布不均的細胞中無法實現全細胞轉錄組測序、對細胞更多次的採樣還需進一步研究等，但該技術首次實現了活細胞連續觀測，為單細胞測序技術發展帶來了更多可能性。未來，團隊將進一步提高Live-seq技術的實用性。
相關論文信息：
https://doi.org/10.1038/s41586-022-05046-9
