導言：經過超過20年的探索與實踐，德國仹犇泰（Phytobiotics GmbH）作為博落回提取物全球專利擁有者，已經成為博落回提取物在動物生產上應用的領軍者。在超過全球2.5%的飼料中添加，世界知名生產企業背書。
「
Valeria Artuso-Ponte,1* Steven Moeller,2 Paivi Rajala-Schultz,1 Julius J. Medardus,1 Janet Munyalo,1 Kelvin Lim,1 and Wondwossen A. Gebreyes1
1、俄亥俄州立大學獸醫學院獸醫預防醫學系，俄亥俄州哥倫布市，美國。
2、俄亥俄州立大學食品、農業和環境科學學院動物科學系，俄亥俄州哥倫布市，美國。
*仹犇泰，巴伐利亞州，瓦盧弗街 10 a 65343 埃爾特維勒， 德國。
摘要
該研究旨在評估草本提取物添加劑的效果，特別是苯並菲啶啶生物鹼（QBA），其先前已被證明具有抗炎，抗菌和免疫調節作用。我們驗證了QBA在將豬運到屠宰場的整理過程中對應激分泌和沙門氏菌感染的作用。共有82頭豬被灌服含有沙門氏菌Meleagridis，Hartford，Bo-vismorbificans和Newport serovars的沙門氏菌混合培養基（第0天），並在2周後隨機分配到三個處理組（第[D]14天）：T1，飼料添加 QBA；T2，飼料和水溶性QBA；CON，對照，無攻毒）。攻毒後將豬運送到屠宰場（D 28），並在近19小時後宰殺（D 29）。從所有豬中收集唾液，糞便樣本和胴體拭子。只有CON對照組顯示，運輸後唾液皮質醇增加（5.48 ng/mL；p <0.0001），相比濃度高於T1（2.73 ng/mL；p = 0.0002）和T2（1.88ng/mL；p <0.0001）。在QBA添加的豬群中，運輸後沙門氏菌的患病率和感染率下降（p <0.05），而對照組在運輸後沙門氏菌感染率顯著增加（p = 0.04）。在D 28時，T2中的豬排出的沙門氏菌數量低於T1（1.3E + 02 CFU / mL與8E + 03 CFU / mL相比；p = 0.002）。此外，CON對照組沙門氏菌的胴體污染高於處理組（p = 0.01）。研究結果表明，QBA添加可有效減少豬的運輸應激，從而減少沙門氏菌的感染，並對動物福利和豬肉安全產生積極影響。
01
介紹
沙門氏菌病是美國住院率和死亡率最高的食源性細菌疾病，每年治療相關費用高達25億美元（Hoelzer，2011）。此外，食用受污染豬肉而感染沙門氏菌的人數佔總沙門氏菌感染病例的1%（Guo，2011）。豬肉可以在食物鏈的任何時候被沙門氏菌污染；然而，進入屠宰場前後受污染被認為是豬胴體污染的主要因素（Davies，2011）。在豬中，沙門氏菌病通常是亞臨床的，受感染的豬可以通過糞便長時間間歇性地排出沙門氏菌（Kranker，2003）。運輸引起的應激已被證明會增加沙門氏菌的感染幾率，即使在農場階段有亞臨床感染的人中也是如此，從而引發食品安全風險（Larsen，2003；Verbrugghe，2011）。抗生素使用的抗菌策略已被廣泛採納，抗生素減少農場一級食源性病原體的發病率（Doyle和Erickson，2012；Looft et al.， 2012）。然而，它們的廣泛使用與耐葯細菌的出現和傳播有直接關聯（Oliver，2009）。草藥提取物的使用，如血根鹼和切利尿嘧啶，已被提議作為使用飼料中抗生素的良好替代品，以增強生長，而不會引起抗生素耐藥性的產生（Yakhkeshi，2011；羅賓斯，2013）。這些化合物是苯並（c）菲啶生物鹼（QBA）和幾種植物的生物鹼活性成分，包括Macleaya cordata提取物，已被證明具有抗炎，抗菌和免疫調節作用（Lenfeld，1981；Colombo and Bosisio，1996）。此外，QBA可以抑制芳香族l-氨基酸脫羧酶，其催化芳香族氨基酸脫羧成為其生物胺；因此，芳香族氨基酸如色氨酸的可利用率增加（Drsata，1996）。色氨酸是一種必需氨基酸， 少於 5% 的總色氨酸通過甲氧基吲哚徑代謝合成中性粒細胞遞質血清素， 其已知可增強動物對應激條件的適應能力。因此批准使用QBA的國家將QBA納入豬和家禽日糧，以提高氨基酸利用率並促進生長（Vieira，2008；Yakhkeshi，2011）。此外，我們的研究小組之前報道過，添加QBA可以減少沙門氏菌感染並改善豬的育雛階段的腸道通透性（Robbins，2013）。然而，QBA添加劑對育肥豬運輸應激反應的影響及其與豬肉安全的相關性尚未得到廣泛研究。
本研究的目的是（1）評估QBA添加劑對唾液皮質醇監測的影響；（2）確定皮質醇水平與沙門氏菌感染的相關性；（3）評估QBA添加劑對沙門氏菌感染和胴體污染的抑制效果。
02
方法
2.1動物與設施
共有82頭豬（初始體重：47.9 – 7.2公斤）備選取做一項隨機對照的抗菌研究。根據動物各窩，品種和性別進行了分組，並被分配到九個圍欄。每個處理組被分配使用三個相鄰的圈籠，並與其他處理組相隔兩個空圈和堅固的物理屏障，以阻止不同處理組之間豬群的直接接觸。豬被安置在俄亥俄州立大學俄亥俄州農業研究發展中心西部農業研究站的部分板條狀的穀倉中。提供自由採食飼料和水。實施生物安全管控計劃，以盡量減少人類對沙門氏菌的接觸，並防止其傳播到農場和屠宰場內的其他動物和設施。下面描述的所有程序均已獲得俄亥俄州立大學機構動物護理和使用委員會的批准。
2.2沙門氏菌攻毒
在第0天（D 0），所有豬都接受了15毫升細菌培養基，每注劑含有多個沙門氏菌菌液培養基混合物，這些沙門氏菌菌落是從研究開始前2周從同一農場的研究豬收集的糞便樣本中分離出來的（Bager和Peterson，1991）。根據臨床實驗室斯坦達斯研究所（CLSI），常駐沙門氏菌培養基包括Bovis-morbificans，Newport，Hartford和Meleagridis。所有分離物均適用於12種抗生素：氨苄西林（10 lg），阿莫西林 - 克拉維酸（30 lg），阿米卡星（30 lg），頭孢曲松（30 lg），頭孢噻吩（30 lg），氯黴素（30 lg），環丙沙星（5 lg），慶大黴素（10 lg），卡那黴素（30 lg），鏈黴素（10 lg），磺胺異惡唑（250 lg）和tet-雷環素（30 lg）， 2012)。使用常駐沙門氏菌攻毒是為了更好地模擬商業農場中的真實流行病學情景。已鑒定沙門氏菌的培養液型是低致病性的，會引起輕度和短暫的疾病癥狀（Wood，1991；維戈， 2009；Ngoc et al.， 2013；傑克遜，2013）；因此，所有豬在（D 9）後9天接受加強劑量（15毫升），以確保菌落定植。初始和攻毒增強劑量都是在Luria-Bertani肉湯中製備的，並且包含大約108個菌落單元（CFU）/ mL（麥克法蘭量表為0.5）。
2.3苯並菲啶生物鹼（QBA）處理
QBA處理包括含有植物成分和Macleaya cordata天然提取物的飼料或水添加劑（Sangrovit®S和Sangrovit® WS；仹犇泰德國Phytobiotics GmbH，埃爾特維爾，德國）。在最初的被灌服攻毒的豬群在攻毒後（D 14）十四天，處理組和對照組被隨機分配到分群圍欄。處理T1（T1；n = 27）的豬接受QBA （相當於商用仹犇威®S） 450克/噸飼料的混拌處理2周時間（Shen，2012a）。處理T2（T2；n = 27）的豬接受了QBA（相當於商用仹犇威®S） 450克/噸飼料添加量長達2周並伴有水溶性QBA（相當於仹犇威®WS） 300克 / 1000升在飲用水中的添加，以增強飼料中QBA的效果。對照組的豬沒有添加任何QBA產品（CON 對照組；n = 28）。
2.4到屠宰場的運輸
在第28天（D 28），所有豬都被運送到俄亥俄州立大學肉類實驗室屠宰場。在拖車中，設置了物理屏障阻止不同處理組的豬之間的直接接觸。在大約45-50分鐘的運輸期後，將所有豬卸載到待宰圍欄，並在大約19小時後宰殺（D 29）。不同處理組的豬在待宰期間不允許直接（鼻對鼻）接觸，處理組在裝載和屠宰過程中交替進行，以避免由於裝載和發病時間的差異而產生潛在的交叉感染，從而可能影響豬的應激狀態。
2.5樣品收集和處理
從所有豬中收集唾液使用棉簽（Salivette® Cortisol，Sarstedt AG & Co.，德國）在D 0，D 14，D 27（運輸前）和D28（運輸後）進行收集。為了避免由於皮質醇的晝夜節律性而產生混淆，在下午1點到3點之間收集了所有樣本，交替了處理組的順序。在研究開始前兩周，所有豬都被引入並用棉簽進行訓練，以盡量減少由於收集程序引起的應激，這可能會影響豬的應激狀況，從而影響唾液皮質醇。讓豬咀嚼棉簽約60秒或直到棉花被唾液完全浸透。然後將棉簽放入收集管的內部，並在冰上運輸到實驗室進行進一步處理。樣品抵達後，所有樣品均在1500 ·g在4°C下持續10分鐘以從棉簽中分離唾液（Shen，2012b）。最後，將唾液儲存在-80°C直至進一步處理。共310個唾液樣本（T1，n = 107；T2， n = 104；CON 對照組，n = 99）一式兩份進行分析，以使用市售酶免疫測定試劑盒（Salimetrics LLC，State College，PA）測定sali-變化皮質醇濃度。每個樣本的類內變異係數 （CV） 計算公式為：標準偏差/平均唾液皮質醇 （ng/mL）*100。然後，計算 310 個樣本的平均 CV%。使用來自每個板中包含的已知低和高唾液皮質醇對照組的斯坦達德偏差/平均唾液皮質醇（ng / mL）*100以及標準品和未知樣品計算測定間CV。基於個方法，測定內和測定間變異係數分別為6%和2.9%。從D 0，D 3，D 14，D 21，D 27和D 28上所有豬的直腸中無菌收集新鮮糞便物質，並單獨放入無菌袋中（Nasco Whirl-Pak®易於關閉；威斯康星州阿特金森堡）一直保持製冷，直到在實驗室中處理。共收集了384個糞便樣本（T1，n = 129；T2， n = 130；CON 對照組，n = 125）和基因組DNA按照製造商的說明使用QIAamp® Fast DNA糞便迷你試劑盒（Qiagen，Valencia，CA）提取，並將純化的DNA保存在4°C直至進一步分析。
在掏空後，在屠宰時最後洗滌和冷卻（D 29）之前，使用無菌海綿（Nasco Whirl-Pak® Speci-Sponge®）從所有胴體（內部和外部表面）收集胴體拭子，並用10mL緩衝蛋白腖水預潤。海綿始終放置在冰上，直到實驗室里處理。為了從胴體拭子中提取基因組DNA，總共72個海綿（T1，n = 25；T2， n = 23；將CON 對照組，n = 24）置於具有50mL 0.02%吐溫20（Sigma，St. Louis，MO）溶液的單個無菌容器中，並在37°C的振蕩器中攪拌30分鐘。隨後，將15 mL液體倒入無菌的15-mL Falcon樣品試管（BD Falcon®；新澤西州富蘭克林湖）並在1500 g 離心10分鐘以獲得顆粒（Guy，2006）。最後，按照製造方法的指示，使用DNeasy®血液和組織試劑盒（Qiagen）提取DNA，並將DNA儲存在4°C直至進一步分析。
通過在Mx3005P機器上進行定量實時聚合酶鏈反應測定（qPCR），在三次切片中分析所有糞便樣品和胴體拭子以定量沙門氏菌（安捷倫科技公司，加利福尼亞州聖克拉拉）。選擇的引物集旨在擴增invA基因的119鹼基對片段，如前所述（正向：5'-TCGTCATTCCATTACCTACC-3'和反向：5'-AAACGTTGAAAACTGAGGA-3'；Hoorfar，2000）。熱循環條件如下：1次循環，95°C下15分鐘（熱啟動），然後是55次95°C循環15 s（變性），55°C循環15 s（退火），72°C循環30 s（延伸）和75°C循環15 s（額外數據採集步驟），1次循環72°C5分鐘（最終延伸）。如前所述，通過繪製已知的腸炎沙門氏菌ATCC 13076與閾值values（Ct）的已知CFU / mL來構建斯坦達德曲線，並使用MxPro® QPCR軟體（Agilent Technologies）進行線性回歸分析以量化沙門氏菌的量（CFU / g或CFU / mL）。
03
統計分析
從最初參加研究的82頭豬中，有6頭豬（T1，n = 1；T2， n = 2；CON 對照組，n = 3）被移除，因為他們在研究期結束前死亡或接受抗生素治療。對於所有連續數據，使用SAS的單變數過程（SAS 9.4；Cary， NC） 在統計分析之前。SAS （SAS 9.4） 的均值過程用於計算均值和均值的標準誤差。使用SAS的混合程序（SAS 9.4）分析唾液皮質醇。將唾液皮質醇隨時間變化的濃度作為重複測量進行分析。豬和豬圈被視為隨機效應。最終模型包括治療效果，樣本收集日，它們的相互作用和性別。對於沙門氏菌檢出，使用SAS軟體（SAS 9.4）進行了非參數測試。進行Kruskall-Wallis試驗，用於分析D0，D 3，D 14，D 21，D 27，D 28處沙門氏菌檢出以及處理組之間的胴體污染。此外，進行了Wilcoxon秩和（Mann-Whitney）檢驗，以在處理組之間進行成對比較。在處理組內也進行了成對比較，並使用Wilcoxon符號排名測試。使用SAS的GLIMMIX程序（SAS 9.4）進行Logistic回歸分析，以測試處理之間和處理內沙門氏菌患病率的差異。豬和豬圈被視為隨機效應。最終模型包括治療效果，樣本收集日及其相互作用。由於收斂性，進行了Fisher精確測試，以測試D 27與D 28處理組之間以及D 3和D 28處理組之間沙門氏菌患病率的顯著差異。通過進行Fisher精確測試來分析胴體拭子中沙門氏菌的患病率。對於所有分析，p值<0.05被認為是顯著的，並且進行了Tukey-Kramer檢驗以調整多個比較子。計算Spearman秩相關係數（rs）以確定D 28處唾液皮質醇與沙門氏菌檢出之間的關聯，並將相關係數的大小解釋為先前描述（Mukaka，2012）。
04
結果
Spearman等級相關係數顯示，在所有組中，唾液皮質醇和沙門氏菌在運輸後檢出之間存在非常顯著的正相關，其中CON 對照組中的rs最高（圖。1；rs = 0.93，p < 0.001），然後是 T1 （rs = 0.85， p = 0.0002） 和 T2 （rs = 0.82， p = 0.0006）。
4.1唾液皮質醇
總體而言，從D 0到D 27的所有組中唾液皮質醇的平均降皺濃度顯著（圖2；p<0.0001）。在運輸到屠宰場（D 28）後，只有CON 對照組的唾液皮質醇與D 27（1.87 ng / mL至5.48 ng / mL，p <0.0001）顯著增加。此外，CON 對照組D 28的平均唾液皮質醇顯著高於T1（5.48 ng/mL vs 2.73 ng/mL，p = 0.0002）和T2（5.48 ng/mL vs 1.88 ng/mL，p <0.0001）。
圖 1.各處理組平均皮質醇對比。在處理組和對照組之間，沙門氏菌檢出（菌落形成單位[CFU]/g糞便）與唾液皮質醇中心（ng皮質醇/mL唾液）之間的相關性。CON 對照組（用基礎飲食控制）；T1（飼料苯並菲生物鹼[QBA]）和T2（飼料中+水溶性QBA）。
4.2沙門氏菌糞便檢測
沙門氏菌患病率達到71.4%~100%範圍區間，D0、D 3、D 14、D 21和D 27的處理組間沒有差異（p >0.05），表明該攻毒有效，並且在整個研究期間沙門氏菌持續檢出（數據未顯示）。在D 28上，與T1（73.7%，p = 0.02）和T2（71.4%，p = 0.02）相比，CON 對照組（100%）豬的沙門氏菌前期顯著更高。此外，與D 27相比，T2中沙門氏菌陽性豬在運輸後的比例顯著下降（95.5%至71.4%，p = 0.05）。
在D 27（圖3；p = 0.0002）和D 28（p = 0.01）的組中，沙門氏菌檢出顯著差異。在D 27（運輸應激之前），與接受飼料中QBA（p <0.0001）或飼料和水溶性QBA（p = 0.001）的豬相比，CON 對照組中的沙門氏菌檢出量較低。在D 28（運輸應激處理後），與T1相比，T2中的豬排出的沙門氏菌數量顯著較低（1.3E + 02 CFU / g與8E + 03 CFU / g，p = 0.002），這意味著當QBA添加到飲用水中時，可能是由於更高的生物利用度（del Castillo，1998）。然而，T2組和CON 對照組之間的差異沒有統計學意義（1.3E + 02 CFU / g與5.9E + 02 CFU / g，p = 0.08）。此外，CON 對照組豬在運輸後沙門氏菌檢出顯著增加（6E + 01 CFU / g至5.9E + 02 CFU / g，p = 0.04）。相反，與轉運前水平（3.8E + 02 CFU / g至1.3E + 02 CFU / g，p = 0.03）相比，T2中的豬在轉場後表現出沙門氏菌檢出的顯著減少。
4.3沙門氏菌胴體檢測
在所有胴體中檢測到37.5%（27/72）的沙門氏菌。任何處理組之間的沙門氏菌患病率沒有顯著差異：QBA（T1和T2組合）與CON 對照組（p = 0.32），T1與CON 對照（p = 0.07），T2與CON 對照（p = 1）或T1與T2（p = 0.07）。然而，受污染的胴體沙門氏菌的數量在處理組之間差異很大（圖4；p = 0.03）。與T1和T2相比，CON 對照組污染胴體的沙門氏菌量顯著更高（3.7E + 01 CFU / mL分別與9E + 00 CFU / mL和1E + 01 CFU / mL相比，p = 0.01）。
圖 2.處理組和對照組唾液皮質醇濃度（ng皮質醇/mL唾液）的比較。CON 對照（用基礎飲食控制）；T1（飼料中四分之一苯並菲啶生物鹼[QBA]）和T2（飼料中+水溶性QBA）。D 27（第27天，運輸前）和D 28（第28天，運輸到屠宰場後）。a，b不同字母表示p<0.05處處理組之間的顯著性。*表示在 P < 0.05 處 D 27 和 D 28 之間的處理中的顯著性。
圖 3.處理組和對照組糞便中沙門氏菌檢出水平（菌落單位[CFU]/g糞便）的比較。CON 對照（用基礎飲食控制）；T1（苯並（c）菲啶生物鹼[QBA]）和T2（飼料中+水溶性QBA）。D 27（第27天，運輸前）和D 28（第28天，運輸到屠宰場之後）。a，b不同字母表示p<0.05處處理組之間的顯著性。*在 P < 0.05 處，在 D 27 和 D 28 之間的處理中，Denotes 意義。
圖 4.處理組和對照組沙門氏菌（菌落形成單位[CFU]/mL）胴體污染的總體比較。CON 對照 對照（用基礎飲食控制）；T1（飼料添加生物鹼[QBA]）和T2（飼料中+水溶性QBA）。a，b不同讓值表示p<0.05處處理組之間的顯著性。
05
討論
這項研究的主要發現如下：（1）運輸對豬來說是一個應激條件，這可能導致唾液皮質醇和沙門氏菌檢出率上升；（2）在飼料和飲用水中添加QBA可有效調節運輸應激反應，降低沙門氏菌感染率和通過糞便排出的沙門氏菌數量。
屠宰場運輸是豬最大的應激條件之一，這可能會對胃腸道的正常功能產生負面影響（Webster Marketon和Glaser，2008；羅斯塔尼奧，2009）。此外，應激與沙門氏菌檢出增加和食品安全風險增加有關（Rostagno，2009）。我們的結果與以前的報告一致，表明只有CON 對照中的豬在運輸後表現出唾液皮質醇的增加，這表明運輸確實是整理豬的應激源。此外，只有未添加的豬在運輸後顯示出Salmo-nella檢出的顯著增加。此外，我們的結果，根據其他研究（Hurd，2002；Ver-brugghe，2011），顯示唾液皮質醇與運輸後沙門氏菌檢出之間存在高度正相關關係，這表明調節應激即是減少沙門氏菌的智選策略。
除了其他生理功能外，QBA已被證明可以減少育成豬的沙門氏菌的檢出率（Robbins，2013）。與Robbins（2013）一致，目前的結果表明，當QBA被包括在飼料和飲用水中時，沙門氏菌陽性豬的比例以及通過糞便轉移到屠宰場後通過糞便排出的沙門氏菌數量顯著下降。在本研究中，約38%的胴體被沙門氏菌污染，並且驗證了此前報道的類似結果（Botteldoorn，2003；Arguello et al.， 2013）. 與T1和T2相比，CON 對照組沙門氏菌的胴體污染數量顯著升高。此外，與CON 對照組相比，T2豬在運輸後糞便排出的沙門氏菌反而較少，這表明進入屠宰線的T2豬的感染程度小於CON 對照組，從而降低了胴體被糞便污染的風險。在本研究中，對唾液皮質醇濃度的分析顯示，與CON 對照組相比，T1豬的轉吸後應激反應顯著降低。然而，T1中較低的應激反應並沒有導致沙門氏菌在運輸到屠宰場後檢出的減少。T1中胴體污染的顯著降低表明可以更好地適應待宰期間的應激，這可能會減少抵達屠宰場的豬群的沙門氏菌在排泄物中的菌落數量，從而降低胴體污染的風險。需要更多的研究來闡明QBA添加劑改善待宰期間應激的調控和沙門氏菌檢出的機制。
總之，這項研究的結果表明，在育肥豬的飼料和飲用水中添加QBA可有效降低沙門氏菌陽性豬的比例和轉運到屠宰場後糞便排泄到屠宰場的沙門氏菌數量，從而減少胴體受污染幾率。此外，結果表明，利用血根鹼和白屈菜紅素添加劑來減少胴體沙門氏菌的污染的方案是成功的。此外，QBA添加劑對由於運輸引起的應激調控反應是有積極影響的，這可能減少了應激對胃腸道的負面影響，減少了沙門氏菌的檢出。需要進一步的研究來確定減少沙門氏菌檢出和減少唾液皮質醇的潛在機制。此外，需要更多的研究來評估QBA添加劑對沙門氏菌抗生素耐藥性的影響。
特別感謝
作者對傳染病分子流行病學實驗室人員的技術援助表示感謝。這項工作得到了德國仹犇泰Phytobiotics Fut-terzusatzstoffe GmbH和美國農業部動物衛生校內資金贊助，並收到俄亥俄州立大學獸醫學院校方的支持。
