當呼吸道病原類型複雜難分，哪些快速檢測技術助力下一步臨床治療

2022年10月17日18:36:46 熱門 1662

今天主要介紹呼吸道病毒快速檢測技術的現狀與發展方向。目前很難定義「快速檢測」，是指「兩個小時」以內拿到結果，還是需要「一天」的時間拿到結果？因為對於一些少見病原體、罕見病原體或者新發病原體來說，很難達到幾個小時就能明確診斷，需要更複雜的技術、更長的時間才能確認。下面講述的「快速檢測」，指的是與傳統的方法相比，得出結果更快的技術。

相關的內容，我可能在不同的場合也涉及過，非常榮幸再次與大家分享。

呼吸道感染性疾病

呼吸道與外界相通，環境中的病毒、細菌、真菌、寄生蟲等可通過吸入方法，引起呼吸道感染，主要上下呼吸道感染。近幾年對病毒的關注比較多，尤其是2019年底延續到現在的的新冠（COVID-19）疫情以來，大家對病毒引起呼吸道感染性疾病或者其他部位的傳染性疾病尤為關注，例如引起呼吸道感染的流感病毒、腺病毒，曾引起院內感染的消化道病毒諾如病毒。此外，人體定植的病毒，如某些冠狀病毒、鼻病毒、巨細胞病毒等，也可能引起呼吸道感染。正是因為呼吸道病原的類型比較複雜，引起的臨床癥狀，與一些細菌感染、真菌感染臨床上難以區分。這就需要一些採用實驗室技術手段檢測病原，明確病原類型，才能明確診斷，決定下一步的臨床治療。

中國成人社區獲得性肺炎診斷和治療指南（2016年版）

2016年版CAP指南提到，我國成人CAP患者中病毒檢出率為15%-34.9%，流感病毒占首位，其它病毒包括副流感病毒、鼻病毒、腺病毒、人偏肺病毒及呼吸道合胞病毒等。病毒檢測陽性患者中5.7%-65.7%可合併細菌或非典型性病原體感染。對於兒童而言，病毒中的呼吸道合胞病毒佔比較大，非典型病原體中的肺炎支原體為主，所以作為兒科醫院的檢驗科或者微生物檢驗室，針對這些特殊的病毒或者非典型病原體的檢測也非常關鍵。

另外，想提醒大家一點，隨著檢測技術的提高，我們現在發現對於引起呼吸道感染的衣原體而言，肺炎衣原體感染的幾率並不是很多，而鸚鵡熱衣原體感染的比例有增高趨勢，常常與鳥類的飼養史有關。對於衣原體而言，不應只單純檢測肺炎衣原體，新生兒，沙眼衣原體是非常重要的病原；對於經常接觸禽類鳥類的呼吸道感染的患者，鸚鵡熱衣原體成為很重要的病原。建議生產廠家要根據不同的流行病學譜和感染的主要病原類型來設計試劑，特別是多重檢測試劑，臨床實驗室也應以此為依據選用相關的試劑。

臨床微生物病原檢測方法學對比

上圖所示，來源於一篇CRITICAL REVIEWS IN MICROBIOLOGY的綜述（DOI: 10.1080/1040841X.2019.1681933），告訴我們目前臨床微生物檢測手段主要包括哪些。分子生物學方法、抗原檢測方法是最常用的檢測病毒的手段，在國外和國內的指南都有推薦。很多指南都不推薦採用快速抗體檢測方法診斷呼吸道病原感染，比如腺病毒感染或者流感病毒感染，檢測抗體，無論是IgM或IgG，單次檢測，價值不是很大。抗原檢測的主要特點是特異性良好，但靈敏度略差，在適宜採樣的前提下，根據患者病毒載量的多少，靈敏度會在40%~70%，不同的文獻報道具有一定差異。另外，有很多細菌侵犯人體後，降解產物進入血液，最終出現在我們的尿液中，然後可以通過尿液去檢測相關的病原感染的情況。比如肺炎鏈球菌感染，檢測尿液肺炎鏈球菌細菌壁的多糖成份（cell wall-associated polysaccharide），或軍團菌（血清1型）感染的時候，檢測軍團菌尿抗原。肺炎鏈球菌尿抗原檢測靈敏度50-80%，特異性在90%以上。重症感染時靈敏度會更高，但是如果病原載量不多的輕症感染或感染的不同階段，靈敏度偏低。目前呼吸道病毒感染尚沒有合適的尿抗原檢測靶標，主要採集鼻咽拭子去檢測抗原，包括流感病毒、腺病毒，或者冠狀病毒。抗原檢測適合病原載量比較高的情況下使用。

還有分子生物學方法，根據靶標的多少，PCR法可分為多重PCR或者單重PCR，未來的發展方向主要是多重PCR，至少是兩重的。目前來說，針對兩三個靶點設計產品，對於常規的分子試劑公司來沒有多少問題。但是我們希望未來能夠針對更多的病原，即拿到一份樣本後，在短時間內針對多種病原靶標進行快速檢測，實現「樣本進，報告出」這樣的「快速檢測」模式，在兩個小時以內完成10種、20種甚至更多的病原檢測，我認為這是非常重要的發展方向。多重檢測可以降低檢測成本。當然，對於一些少見病原或者極為罕見的病原，實驗室不可能針對這種病原專門設計試劑，從經濟效益上講不太合算。所以像這些情況，做宏基因組測序會更有價值。目前可以在一個體系裡面加入幾十種甚至幾百種引物，先擴增，再測序，這就稱為tNGS，這種方式的理論上講靈敏度也很高，成本將來有可能降低，但還沒有廣泛應用於臨床檢測工作中。

提到分子生物學方法，我們總會想到PCR法、宏基因組測序等方法。實際上分子生物學方法現在已經多種多樣了，比如恆溫擴增技術、基因晶元等，只是這些應用相對來說比熒光定量PCR和宏基因組測序要少一些。近幾年應用恆溫擴增技術逐漸增多，PCR要有反覆升溫、降溫的過程，對反應速度有影響，對於儀器設備要求也高。而恆溫擴增去掉反覆升降溫的過程，使速度提高，但一般恆溫擴增的靈敏度與特異度會低於PCR。還有美國的張鋒教授發現的CRISPR技術，現在也慢慢應用到分子生物學檢測的領域中，靈敏度很高，也許未來會成為分子生物學檢測非常重要的一個方向。

病原體檢測技術發展——核酸檢測

對於傳統微生物學方法，現在病毒培養方法應用的越來越少，在一些專門的科研機構和CDC部門需要活病毒開展研究工作時會使用。因為做病毒培養對實驗室的硬體條件及人員防護要求更高，對於常規的一線的臨床實驗室，從人力成本和經濟效益來看不好維持。後來慢慢過渡到免疫學方法，免疫學方法分為抗原檢測和抗體檢測。如前所述，抗體檢測不太適合常規的呼吸道病毒檢測與臨床診斷，更適於回顧性分析。抗原檢測簡單易行，別有優勢。分子生物學方法，根據DNA病毒或者RNA病毒去專門設計不同的引物進行相關的擴增。

新型冠狀病毒抗原檢測

這是國內近期發表的一篇文章。即採用抗原方法檢測新型冠狀病毒感染，歐美的一些國家很歡迎抗原檢測方法，非常快速、操作簡單，缺點是靈敏度偏低。我們沒有用過這樣的檢測試劑，因為國內的陽性也比較少。可能在一些高發地區，抗原檢測具有一定價值，可用於可疑人員的初篩。

膠體金法不能作為病毒感染陰性確診標準

為什麼我們一直說用抗原檢測不能夠作為病毒感染陰性的確診標準，就是因為靈敏度不夠。比如患者的確是流感病毒感染、腺病毒感染或者呼吸道合胞病毒感染，但如果病原載量較低，或者是採樣是咽拭子，沒有采鼻咽拭子，或者採樣的時候沒有採到相應部位，本來應該從鼻腔進去，進去的程度要深一些，到鼻咽部的位置，實際中拭子進得較淺，採的是鼻拭子。或者病程較長。以上種種情況都會大大降低陽性率。所以，抗原檢測結果如果是陰性，而患者的癥狀比較像，還是不能排除。建議用更靈敏的分子生物學檢測方法。不同分子生物學檢測方法的靈敏度還是存在一定差異，不同廠家之間差異比較大，所以我們建議實驗室在使用某一種試劑之前要做好相應的評估。

流感病毒

在沒有新冠病毒之前，我們特別關注每年的流感病毒。我們實驗室每到秋冬季，每天都檢出相當多的甲、乙型流感病毒。由於新冠疫情，大家開始佩戴口罩、採取個人防護等措施，2020年度-2021年初流感基本上已經「絕跡」了。可見控制新冠病毒的這種方式對於控制流感、控制呼吸道合胞病毒或腺病毒的感染流行都十分有效。

呼吸道合胞病毒（RSV）

呼吸道合胞病毒（RSV）主要見於一些免疫力比較低下的老年人群和學齡前兒童。RSV佔2歲以下兒童下呼吸道感染住院原因的42-45％，尤以新生兒及6個月內嬰兒為易感人群。一般來說癥狀比較輕，以咳嗽、喘鳴等呼吸道癥狀為主，可引起間質性肺炎、毛細支氣管炎等。如病情嚴重或反覆發作，可發展為支氣管哮喘，導致呼吸衰竭等。當RSV與其他呼吸道病毒合併感染時，可能引起嚴重後果。

柳葉刀：以RSV為主的病毒已經成為中低收入國家重症兒童肺炎的主要病因

這是一項橫跨亞非兩大洲七個國家的多中心研究，自1980年以來同類研究中規模最大、最全面的研究，發表在2019年《柳葉刀》雜誌。在兒童人群中：其中呼吸道合胞病毒導致的肺炎佔到了全部病例的31.1%，而細菌僅佔27.3%，結核分枝桿菌佔5.9%，其餘為真菌和其他病原體。這一文獻告訴我們RSV已經成為非常重要的一類感染的病毒，尤其是兒童群體。所以作為兒童醫院，建議至少有一種檢測呼吸道合胞病毒的方法，可採用抗原快檢試劑，也可是分子生物學檢測方法。我們不要把所有的精力都關注在新冠病毒上，實際上其他的病毒還是會給我們帶來一定的影響。

呼吸道合胞病毒做抗原檢測不一定很靈敏，有一部分人檢測不出來，特別是病原載量比較低的時候，這時候建議採用核酸檢測的方法。

上圖所示，如果有些公司自己製備試劑的話，可以考慮甲型/乙型流感和呼吸道合胞病毒一起檢測。

上圖所示，除了常見的病毒，還可以納入百日咳、衣原體、軍團菌等進行多重快速病原學檢測。檢測結果與病原載量有關。如果病原載量比較多，常規的方法會得到陽性結果；但是如果病原載量非常少，如PCR檢測的CT值在30個循環以上的話，這時候檢測結果並不一定很準確，靈敏度可能下降，需要注意。

傳統病原學檢測方法仍有臨床無法滿足的需求

mNGS、WGS和tNGS的應用

宏基因組測序在近幾年應用較為廣泛。在這次新冠病毒發現的過程中，有賴於宏基因組測序的使用。換句話說，我一直在強調對於少見病原、新發病原，或者從國外旅行回國感染的旅行相關感染，一般實驗室很難針對這一類病原體設計檢測方法，的確有賴於宏基因組測序。

實際上基因組測序不一定要做宏基因組測序。還有其他的方法，如上圖所示，WGS主要是針對某一個分純的菌落測序，檢測其毒力特徵、耐葯特徵、質粒分布、進化情況、同源性分析等。比如分枝桿菌，做葯敏實驗的話需要很長時間、需要特殊的條件，但是可以做WGS基因組測序，檢測耐葯基因，其耐葯大多數都是通過點突變所致，和真實的葯敏實驗結果匹配良好。

還有tNGS，這是指有靶向的測序，先把需要檢測的片段給擴增出來，然後再去測序。比如我只關心樣本裡面的細菌，就可以先把16s這個片段擴增出來，然後再去測序。若關心真菌的話，可以把ITS片段擴增出來，再去測序。還可以在這個體系裡面加入我關心的數十種或上百種病原的引物，擴增後測序。這樣的優點就是不用去測人基因組，降低成本，提高靈敏度。我們做mNGS的時候，實際上有相當一部分測序都耗費在人基因組上面。

上圖所示，前段時間國內的科研人員在JCM發表的文章，他是做非結核分支杆菌的分類，先把很多個序列擴增出來以後再去測序，採用tNGS，也是非常重要的一個發展方向。

有一點想要提醒大家，我們做病毒檢測並不是檢測出來都有臨床價值。如上圖所示，有些病毒容易出現在無癥狀感染者體內，包括鼻病毒、部分冠狀病毒等，但是流感病毒很少出現在無癥狀患者身上。解讀結果，即要看病原的類型，還要關注臨床的情況。

上圖所示，這是前段時間中日呼吸中心總結的文章，發現呼吸道合胞病毒如果和甲流或乙流合併感染，患者的死亡率增加。這就告訴我們，臨床檢測的時候不能只關注一種病原，一種病毒感染以後引起另外一種細菌感染，比如肺炎鏈球菌或者金黃色葡萄球菌的感染，或者兩種病毒同時感染，這種情況有可能發生。如果忽略另一種病原感染的話，可能治療有失偏頗，會引起很嚴重的臨床後果。

小結

兒童和成人病毒感染均不容忽視，很多微生物的建設忽視了病毒感染這方面，免疫力低下人群的病毒性肺炎更應該引起我們關注。隨著基因組測序技術的應用，病毒感染逐漸被大家認識了解。快速多重PCR檢測是未來發展的重要方向，希望試劑公司能夠了解臨床需求。另外，宏基因組測序雖然在發展中，但是診斷新發病毒或罕見呼吸道病毒感染，多重感染，具有獨特優勢，我們應該認識到它的優點和缺點。不同的NGS測序會逐漸應用到更多的場景中，為臨床醫生提供更多的便利。

線上答疑討論

主持人王一民：對於床旁病原學快速檢測（M-ROSE）技術來說，我理解的M-ROSE技術就是把顯微鏡放到床旁，標本快速在床旁鏡檢的技術，無論是通過傳統的革蘭氏染色法，還是再增加一些針對細胞學的瑞氏染色法，去看細胞和病菌之間的關係，去判斷病原是致病、污染，還是定植，除了檢測技術方面，在這些方面有沒有提高？

魯炳懷：M-ROSE技術是近幾年比較熱門的一項技術，在臨床拿到樣本後，及時快速對樣本進行染色。最近我知道有些公司在做自動掃描，通過人工智慧識別，把相應的細胞、病菌大致區分。我發現臨床上大部分是在高倍鏡下（400倍）看，實際上在高倍鏡下看的話，只能看到一個大概印象，簡單推測。臨床微生物實驗室習慣用油鏡（1000倍）鏡檢。如果樣本細菌或真菌數量很多，用高倍鏡尚可；但是病原數量很少的時候，在高倍鏡下僅可以推斷。

未來主要的發展方向，快速多重PCR檢測應該是一個非常重要的方向。比如患者是鏈球菌引起的非常重症的感染，有時候在鏡下是看不到肺炎鏈球菌的，使用藥物以後，鏈球菌已經消失了，但是它感染非常嚴重。M-ROSE、實驗室的顯微鏡檢，是靈敏度不高的快速檢測手段。比如結核分枝桿菌，顯微鏡檢出的陽性率不會超過30%。目前結核分枝桿菌檢測更靈敏的是Xpert。我認為把快速診斷前移到床旁，患者馬上取得樣本，馬上去檢測，這是一個非常好的發展方向。第一，能夠開展這樣實驗的話，表明臨床對病原學檢測這件事情非常重視；第二，有利於人工智慧形態學的快速發展，有需求的時候可能才有這種發展，這樣技術結合非常有前景。

主持人王一民：有些同道請教您有關核酸檢測方面的問題。現在新冠病毒是因為我們可能考慮環境暴露和感染的風險，更多的是採集口咽拭子或鼻咽拭子。但是對於其他病原，可能採集痰液或者做肺泡灌洗液比較多。那麼，對其他病原能不能也像新冠的核酸檢測一樣，能不能簡單點，只採口咽拭子或鼻咽拭子？

魯炳懷：對於很多呼吸道病毒來說，采鼻咽拭子是一種很好的方式。因為正常人相對來說很少有這些病毒（如流感病毒、腺病毒）的定植，在上呼吸道檢測出來，大致可以推測患者有相關的感染。但是對於細菌和真菌完全不是這樣，如鼻咽部可能有大量的金黃色葡萄球菌、化膿鏈球菌、肺炎鏈球菌的定植，絕對不能夠以上呼吸道鼻咽部採集的樣本中含有細菌、真菌的情況來反映下呼吸道的感染。技術再好，採樣是最重要前提，最好的採樣方法就是離感染部位最近的位置採集樣本，所以對於肺炎來說，即使是病毒感染，我也相信留取肺泡灌洗液會比鼻咽拭子檢測靈敏度會更高。還有一個原因，現在做新冠病毒大多是篩查，而不是患者真正出現了肺部感染癥狀。對於多數的呼吸道病毒感染，如果有肺部的癥狀，鼻咽拭子可能也是陰性的，采肺泡灌洗液才是最佳的選擇。舉個例子，之前有位呼吸科大夫懷疑一位患者是結核感染，上午來就診後，採集痰樣本去做痰檢，結果為陰性，下午剛好又做了肺泡灌洗液，結果為陽性。所以，越接近感染部位採集的樣本，一定反映真實的感染的病原，絕對不能夠說把新冠病毒採集核酸檢測進行大面積人群普篩這種特殊情況推而廣之。

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