Nature Methods | 里程碑！ReLiC开创RNA功能研究新纪元

分类：科学

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2025-06-06

引言

dna是生命的蓝图，承载着所有遗传信息。但真正让生命“活”起来、执行指令的，是dna转录出来的rna。然而，这些rna分子并非一劳永逸，它们从诞生到消亡，会在细胞内上演一场场精密的“分子舞步”：剪接 (splicing) 决定基因的最终面貌，翻译 (translation) 将遗传信息转化为功能蛋白，而降解 (decay) 则确保了分子的更新与平衡。这场复杂舞蹈的“编舞者”，正是数千种被称为rna相关蛋白 (rna-associated proteins, rbps) 的“幕后英雄”。一旦这些精妙的调控环节出现哪怕一丝失衡，就可能导致癌症、神经退行性疾病等多种严重的人类疾病。

长期以来，研究人员对这些rna“隐秘舞步”背后的调控网络知之甚少。传统的基因筛选方法，往往只能通过间接的细胞表型（如细胞生长或荧光信号）来窥探，不仅耗时耗力，还难以直接揭示哪些基因精准调控了rna的特定代谢事件。这就像我们只能看到舞蹈的最终效果，却无法看清每个舞者的精确动作和他们之间的互动，更别提幕后指挥家的意图了。

5月29日《nature methods》的研究报道“decoding post-transcriptional regulatory networks by rna-linked crispr screening in human cells”，带来了一项革命性的突破——relic（rna-linked crispr）筛选平台！这项前沿技术巧妙地将crispr基因编辑的强大精准性与条形码rna读数的巧妙结合，就像为细胞内的rna世界安装了一个“分子侦探”，能够以前所未有的深度和广度，大规模解码每个基因敲除后，数千种rna代谢过程的精微响应。它不仅揭示了生命蓝图的“幕后英雄们”如何协同工作，更打开了探索细胞功能、疾病发生发展新机制的全新视角。

革命性工具：relic闪亮登场，破解rna调控难题！

relic (rna-linked crispr) 这项技术巧妙地将crispr基因编辑的精准性与条形码rna读数的灵活性相结合，实现了对人类细胞中2,092个已知rna相关蛋白基因敲除后，各种rna代谢过程响应的量化测量。

relic的核心创新在哪里？想象一下，relic就像一个精密的“分子侦探工具包”，它采用了一种迭代整合策略：

首先，在一个明确的基因组位点，稳定整合编码cas9酶（crispr基因编辑的关键酶）的基因。

接着，再整合一系列携带着特定条形码 (barcoded reporter libraries) 的单向导rna (single-guide rnas, sgrnas) 报告库。这些条形码会与特定的sgrna以及rna报告分子牢固地“绑定”。

这种创新的位点特异性整合策略 (site-specific integration strategy) 避免了传统慢病毒递送 (lentiviral delivery) 中可能出现的sgrna与条形码链接混乱，以及rna条形码表达不稳定的问题，确保了实验的准确性和可重复性。

在初步验证中，研究人员发现，relic在hek293t和u2os细胞系中能够均匀表达荧光报告基因，并在cas9酶的介导下有效敲除目标基因。构建的最终文库针对2,190个基因（包括非靶向对照和必需基因靶向对照），每个基因平均有四个sgrna对。通过对克隆的质粒文库进行深度测序，他们成功地将n20条形码与sgrna进行了关联。数据显示，超过99%的sgrna和100%的基因都至少有一个可检测到的条形码，平均每个sgrna对有8个条形码，这充分保证了文库的复杂性和覆盖度。

此外，relic能够准确捕捉基因扰动对细胞适应性 (fitness effect) 的影响。研究发现，在cas9诱导后的第13天和第21天，与已知必需基因 (essential genes，共745个) 相关的条形码在基因组dna和mrna中的丰度均显著降低。在第13天，条形码在mrna中的丰度变化与基因组dna中的变化相关性高达0.89，到第21天更是达到0.90，这表明relic不仅技术重复性高，还能有效反映基因敲除对细胞整体状态的影响。

解密翻译的奥秘：核糖体占有率之舞

翻译是生命从基因到蛋白的“临门一脚”。relic首次将crispr筛选与核糖体分级技术 (polysome fractionation) 相结合，根据mrna上的核糖体 (ribosome) 数量来测量其翻译效率，这在现有crispr筛选方法中是无法直接实现的。

研究人员使用了一个β-珠蛋白 (β-globin) 报告基因，它是一种翻译效率很高的mrna模型。实验结果显示，在未受扰动的细胞中，超过75%的β-珠蛋白mrna存在于重多核糖体 (heavy polysome) 部分，这代表它们正在高效地被翻译。

通过分析数千个基因敲除对核糖体占有率的影响，研究团队取得了惊人发现：

翻译的核心引擎：毫不意外，敲除细胞质核糖体蛋白 (cytoplasmic ribosomal proteins) 和核糖体生物合成因子 (ribosome biogenesis factors) 会导致重多核糖体/单核糖体比率大幅下降。这就像拆掉了生产线上的关键部件，生产自然停滞。研究还发现，敲除大型核糖体蛋白和生物合成因子，对mrna在核糖体上结合的影响更大。

翻译启动的关键：多数翻译起始因子 (translation initiation factors, eifs) 的敲除也会降低核糖体占有率，尽管其影响通常小于核糖体蛋白的敲除。例如，eif3复合体的七个亚基（a-e、g和i）被确定为关键调控因子，它们的缺失显著降低了核糖体占有率。

意想不到的“幕后操手”：除了核心翻译机器，研究还发现了一些非经典翻译调控因子。比如，与mrna降解和腺苷酸化调控有关的ccr4-not复合体 (cnot1、cnot2、cnot3和cnot7) 亚基的敲除，也显著降低了核糖体占有率。更令人惊讶的是，敲除蛋白酶体 (proteasome) 和tric伴侣蛋白 (chaperonin) 亚基也导致核糖体占有率显著下降，其幅度可与核心翻译起始因子敲除相媲美。这表明，细胞内的蛋白稳态 (proteostasis) 与翻译过程存在着紧密的互调控关系。

那么，哪些基因敲除反而增加了核糖体占有率呢？研究发现，eef2、eif5a和eef1a1的敲除会提高核糖体占有率，这与它们在促进翻译延伸 (translation elongation) 中的作用一致。有趣的是，作为核糖体关联质量控制因子 (ribosome-associated quality control factor) 的ascc3成为重多核糖体/单核糖体比率增加的最高命中基因（log2(h/m) = 0.62）。ascc3负责解离停滞的核糖体，这暗示即使是高效翻译的mrna，也可能存在一定程度的核糖体停滞和质量控制需求。核糖体碰撞传感器 znf598 和新生多肽n端甲硫氨酸去除酶 metap2 的敲除也增加了核糖体占有率，这进一步揭示了新生肽处理对mrna翻译动力学的影响。

剪接的艺术：sf3b家族的精妙调控

rna剪接是真核生物基因表达的另一个核心过程，它负责从前体mrna中移除内含子 (introns) 并连接外显子 (exons)，以产生成熟的mrna。relic的独特之处在于，它能直接测量同一条形码携带的不同剪接异构体 (splice isoforms) 的比例，从而精准捕捉基因扰动对剪接的影响。

研究团队再次利用β-珠蛋白报告基因，这次关注了三种不同的剪接异构体：内含子1滞留 (intron 1 retention)、内含子2滞留 (intron 2 retention) 和外显子2跳跃 (exon 2 skipping)。结果显示，随着cas9诱导时间的延长，识别到的基因命中数逐渐增加。

筛选结果揭示了剪接过程的复杂网络：

核心剪接体 (spliceosome) 组件：大量基因命中集中在核心剪接体组件和剪接相关因子上，它们分布在剪接周期的各个阶段。例如，cdk11b和rna聚合酶iii亚基brf2等被识别为剪接功能的反式调控因子 (trans regulators)。

内含子滞留的调控：内含子1滞留的增加与mrna翻译和核rna外切体 (nuclear rna exosome) 因子有关。这可能通过影响无义介导的mrna降解 (nonsense-mediated decay, nmd) 来起作用。研究发现，外显子连接复合体 (exon-junction complex, ejc) 成分（如magoh、eif4a3、rbm8a）和rna输出因子（如ncbp1、ncbp2）仅在内含子1滞留筛选中被识别为命中基因，这与nmd的已知触发机制相符。

sf3b复合体：剪接的“艺术家”： sf3b复合体是u2小核糖核蛋白 (u2 snrnp) 的关键组成部分，在剪接位点选择中发挥重要作用。令人惊叹的是，sf3b复合体的不同亚基（sf3b1-7）对剪接事件有着截然不同的影响，尽管它们对于细胞生长都是必需的。例如：

外显子2跳跃： sf3b1、sf3b2、sf3b3和sf3b5的缺失会导致外显子2跳跃显著增加，而sf3b7（phf5a）的缺失仅轻微增加，sf3b4和sf3b6的缺失则没有影响。

内含子滞留： sf3b6和sf3b7的缺失增加了内含子2滞留，而sf3b1、sf3b2和sf3b5的缺失增加了内含子1滞留。

这些结果提示，sf3b复合体的不同亚基在调控特定剪接事件（如外显子跳跃或内含子滞留）方面可能存在功能上的分工。通过对内源性mrna进行rna测序 (rna-seq) 验证，研究发现，sf3b5的缺失导致45个注释的盒式外显子 (cassette exon) 发生10%或更高的跳跃，而sf3b6或aqr的影响则小于10个外显子。这项工作不仅揭示了sf3b家族对剪接的精妙调控，也为理解其在疾病中的作用提供了新的视角。

守卫mrna质量：nmd巡逻队的高效运作

细胞内部有一支名为nmd (nonsense-mediated mrna decay) 的“巡逻队”，专门负责识别和降解含有提前终止密码子 (premature termination codon, ptc) 的异常mrna，以防止其翻译出有毒的截短蛋白。relic能够精确测量基因敲除对ptc报告基因mrna水平的影响，从而识别nmd途径的关键调控因子。

研究人员构建了一个在第二个外显子位置引入ptc的β-珠蛋白报告基因。在稳态条件下，这个含有ptc的报告基因mrna水平相比正常终止密码子 (normal termination codon, ntc) 的报告基因显著降低，这证实了nmd的有效性。通过relic筛选，研究识别出90个基因敲除会增加ptc报告基因的mrna水平，这其中就包括了nmd途径的核心组分，如upf1、upf2、smg1、smg5和smg7。这再次证明了relic在识别特定rna质量控制因子方面的强大能力。

令人惊喜的是，除了nmd核心因子，筛选还发现一些参与内质网 (endoplasmic reticulum, er) 和线粒体 (mitochondrial homeostasis) 稳态的基因（如hspa5、hspa9和phb1）的敲除也会增加ptc报告基因的水平。这与先前的研究一致，即内质网和线粒体稳态的扰动会导致eif2a磷酸化，从而抑制nmd。

为了进一步深入探究，研究团队还利用relic进行了化学修饰剂筛选 (chemical modifier screen) 和遗传修饰剂筛选 (genetic modifier screen)。

在化学修饰剂筛选中，他们使用isrib（一种能使翻译对eif2a磷酸化不敏感的小分子）处理细胞。结果发现，30个基因敲除会降低ptc报告基因的mrna水平，其中就包括了内质网/线粒体蛋白和氨酰trna合成酶 (aminoacyl-trna synthetases)。

在遗传修饰剂筛选中，他们敲低了eif2a激酶gcn2（当氨酰trna合成酶受抑制导致未充电trna积累时，gcn2会被激活）。结果显示，在降低gcn2表达后，12个基因敲除（其中10个是氨酰trna合成酶）导致ptc报告基因水平降低。

这些精密的组合筛选策略，就像剥洋葱一样，层层揭示了基因产物调控rna过程的分子途径，为我们理解细胞如何维护mrna质量提供了前所未有的细节。

药物的幕后舞者：hht与gcn1的意外邂逅

最后，relic被应用于一个实际的生物医学问题：揭示细胞对高三尖杉酯碱 (homoharringtonine, hht) 这种抗白血病药物的响应机制。hht是一种靶向核糖体的化疗药物，通过抑制蛋白合成来治疗慢性髓性白血病。然而，细胞如何响应这种翻译抑制，仍有待深入理解。

研究人员使用增强型黄色荧光蛋白 (eyfp) 作为报告基因，并用hht处理细胞。relic筛选结果令人瞩目——gcn1，一个在正常筛选中并非显著命中的基因，成为唯一的显著命中基因（fdr < 0.05）。gcn1的敲除会显著增加eyfp mrna的水平。

gcn1作为核糖体碰撞传感器 (ribosome collision sensor)，通常在氨基酸受限时激活激酶gcn2，从而引发eif2a磷酸化。研究发现，hht处理后，在gcn1缺失的细胞中，p38的磷酸化水平增加，而这种增加是依赖于zak激酶的。进一步的rna测序分析显示，hht处理在gcn1缺失的细胞中导致了60个基因（包括fos、jun和myc等即时早期基因 (immediate early genes, iegs)）的差异上调。这些发现被进一步验证，并发现zak或gcn2的药理学抑制可以阻止gcn1缺失细胞中ieg的上调。

这些数据强有力地表明，gcn1在hht治疗引起的核糖体碰撞应激中扮演着关键的缓解角色。它像一个“警报器”，感知核糖体碰撞，并触发下游信号通路来应对这种应激。

relic的广阔天地

relic技术不仅成功揭示了rna翻译、剪接和降解过程中的核心调控网络，还识别出许多意想不到的因子和它们之间的复杂关联。它能捕捉到同一蛋白复合体内部不同成员的差异化效应（如sf3b复合体），也能识别出直接效应器和间接调控者。

当然，relic作为一项新技术，也有其局限性，比如它目前依赖于异源表达的报告基因，并且需要位点特异性整合，这可能限制其在某些细胞类型中的应用。然而，研究人员已提出多种改进方向，包括：

引入更多基因编辑工具，如碱基编辑器 (base editors) 和先导编辑 (prime editors)，以实现更高分辨率的核苷酸层面的rna代谢研究。

使用非编码rna (non-coding rnas) 和病毒rna作为报告基因，探索新型rna调控机制。

将relic文库扩展到所有蛋白编码基因，以揭示rna代谢与其他细胞过程之间更广泛的相互作用。

总而言之，relic为我们提供了一个前所未有的强大工具，能够大规模、高通量地“解码”人类细胞中复杂的转录后调控网络。这项研究不仅加深了我们对生命基本过程的理解，也为未来开发针对rna代谢疾病的治疗策略奠定了基础。

参考文献

nugent pj, park h, wladyka cl, yelland jn, sinha s, chen ky, bynum c, quarterman g, lee sc, hsieh ac, subramaniam ar. decoding post-transcriptional regulatory networks by rna-linked crispr screening in human cells. nat methods. 2025 may 29. doi: 10.1038/s41592-025-02702-6. epub ahead of print. pmid: 40442371.

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