Nature Biotechnology | 小身材，大作为：研究人员如何“炼”出超强迷你基因编辑器NovaIscB？

分类：科学
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引言

如果我们可以精确地改写生命的蓝图，纠正那些导致遗传疾病的微小错误，或者巧妙地调控基因的表达，让细胞按照我们的意愿行事。这不是遥远的幻想，而是基因编辑技术正在开启的未来。长期以来，crispr-cas9系统一直是这场革命中最闪耀的明星，它像一把精确的分子剪刀，为研究人员提供了前所未有的力量。然而，就像任何强大的工具一样，cas9在真正应用于人体治疗时也面临挑战——它的“体型”相对较大，这限制了通过常见的病毒载体（如腺相关病毒，aav）进行高效安全的全身递送。更关键的是，要在广阔复杂的基因组中做到真正的“指哪打哪”，同时保持高效率和极低脱靶，仍然是需要不断攻克的难题。

于是，研究人员的目光投向了自然界的宝库。在演化的漫长历史中，生命孕育了无数巧妙的分子机器。omega系统中的iscb蛋白，作为cas9演化上的远亲，以其显著“迷你”的身材（约是spcas9的三分之一）引起了研究人员的兴趣。这种紧凑性是aav递送的天然优势。但早期的研究也发现，iscb系统似乎有着“小身材”的烦恼：它的引导rna有效长度较短，这可能导致特异性不如人意，让它更容易结合到与目标序列有少量错配的非靶点上。如何在微小的iscb骨架上，同时实现媲美甚至超越cas9的强大活性和精准特异性？这是将iscb从实验室的发现推向临床应用必须解决的关键问题。
5月7日《nature biotechnology》的研究报道“evolution-guided protein design of iscb for persistent epigenome editing in vivo”，正是迎接这一挑战的探索之旅。研究人员没有止步于简单的筛选，而是结合了自然多样性的海选、基于蛋白质结构的理性设计以及前沿的深度学习辅助预测，对iscb进行了前所未有的深度改造。通过一系列巧妙的“工程手术”，包括借鉴cas9智慧的结构域嫁接和精细环路重塑，以及对引导rna的优化，最终创造出一个全新的、既紧凑又高效且高度特异的iscb变体。更令人兴奋的是，利用这个微型新星，构建一个同样紧凑的可编程表观基因组编辑器，并首次证明它可以通过单一aav载体在小鼠体内实现长达数月的持久基因沉默。
海选千里：在自然宝库中寻找更好的起点
为了找到一个更好的出发点，研究人员进行了一场针对iscb直系同源蛋白（orthologs）的大规模“海选”。他们首先筛选并测试了144种iscb蛋白和6种与iscb演化关系较近的ii-d型cas9蛋白在体外的活性，并确定了它们的靶点相邻基序（tam）偏好。在这个初步阶段，发现除了之前报道的ogeuiscb，还有tbaiscb和两种ii-d型cas9蛋白表现出体外活性。这些蛋白的一个共同特点是，它们的桥接螺旋（bridge helix, bh）和ruvc-ii区域之间插入了rec结构域，类似于ogeuiscb中的β折叠rec连接体。
这促使其进行了第二轮更有针对性的搜索，重点寻找包含这类rec插入结构域的iscb蛋白。他们又筛选了240种iscb蛋白，并在体外和人类细胞中进行了测试。最终，共鉴定出了10种在人类细胞中表现出基因编辑潜力的iscb蛋白以及2种ii-d型cas9蛋白。
在这批“候选人”中，orufiscb（492个氨基酸）脱颖而出。通过对20个不同靶点进行测试，orufiscb在人类细胞中表现出最高的插入-删除（indel）效率，在14个位点检测到了indel，效率范围在0.2%到8%之间。这比之前报道的ogeuiscb系统的活性提高了5到10倍。orufiscb主要识别ntaaa tam，但也能识别非规范的ataaa tam。
研究人员进一步探究了orufiscb的“有效引导长度”（effective guide length），也就是为了实现切割活性所需的最小引导-靶标匹配碱基数。结果显示，orufiscb在使用14-15 nt引导rna时效率最佳，使用短至13 nt的引导rna也能检测到活性。相比之下，spcas9通常需要18-20 nt的引导rna，且在使用短于16 nt的引导rna时几乎没有活性。iscb相对较短的有效引导长度（14-15 nt vs spcas9 18-20 nt）可能是其特异性较低的一个原因，因为完美匹配的短引导序列在人类基因组中有更多的潜在非靶点。因此，提高iscb的有效引导长度是增强特异性的关键。
智慧嫁接：为“小身体”植入“大智慧”——引入rec结构域
基于orufiscb，研究人员开始了蛋白质工程的征程，目标是同时提升活性和有效引导长度。其核心想法是借鉴cas9系统通过其rec结构域与引导rna:靶标dna异源双链体互作的方式，在orufiscb中插入或工程化类似rec的结构域，以增强其对延伸异源双链区域的识别和稳定性，从而增加有效引导长度并提高错配检测能力。
通过alphafold2对多种iscb和cas9蛋白结构进行建模，研究人员发现cas9的rec结构域是一个广泛的插入区域，可以与rna:dna异源双链体的tam远端区域相互作用。研究人员推测，将rec结构域插入orufiscb的合适位置，可以增加蛋白质与引导-靶标异源双链体接触的表面积，从而可能提高有效引导长度。
研究人员在orufiscb骨架中选择了rec结构域的插入位点，并构建了14个orufiscb-rec嵌合体。在体外dna切割实验中，其中12个嵌合体保留了dna切割活性。进一步在人类细胞中测试发现，来自ii-d型cas9蛋白（如nba-1）和czcbiscb的rec结构域嵌合体表现出显著活性。特别是包含nba-1 rec结构域的嵌合体，称之为orufiscb-rec，在人类细胞中的活性平均提高了高达20倍。
然而，初步的点突变测试显示，简单的点突变可能会影响蛋白与dna的整体结合亲和力，而不能显著区分靶点和非靶点结合。需要一种更精妙的方法来提高特异性。
精雕细琢：重塑rec区域，平衡活性与特异性
为了创造一个更高特异性的novaiscb变体，研究人员在第三步工程化中着重优化orufiscb-rec。其策略是修改蛋白质柔性区域中的多个残基，特别是通过交换nba-1 rec结构域中的突出环（extruding loops），希望借此引入新的上位效应（epistatic effects），使系统能够优先结合靶点dna而非非靶点dna。研究人员利用了自然界中rec结构域的多样性，从其他rec结构域中提取了不同的环序列进行交换。
他们构建了52个单一环交换变体，并在人类细胞中测试了它们在使用20 nt和14 nt引导rna时的活性。发现其中一个交换变体（swap 49）在不降低活性的情况下，显著提高了使用20 nt和14 nt引导rna时的indel活性比率，表明它可能比orufiscb-rec更具特异性。swap 49源自nbacas9-2蛋白。
为了理解swap 49提高特异性的机制，研究人员解析了orufiscb-rec-swap 49的低温电子显微镜（cryo-em）结构，分辨率达到了2.72 Å。结构显示，插入的rec结构域向引导-靶标异源双链体的tam远端延伸，稳定了更长的异源双链区域。特别是，结构中可以看到引导-靶标异源双链体被解析到20 bp，而之前ogeuiscb的结构只解析到14 bp。这印证了增加有效引导长度的设想。此外，结构还揭示了iscb的催化切割机制：hnh结构域通过一个三方组氨酸簇协调一个镁离子进行切割，ruvc结构域协调两个镁离子。这些结构细节为进一步工程化提供了重要线索。
研究人员将表现最佳的单一环交换变体组合起来，构建了54个双环交换组合。在人类细胞中测试这些组合发现，某些双环交换组合在保持与orufiscb-rec相似的靶点活性的同时，显著降低了使用14 nt引导rna时的活性，使得使用20 nt和14 nt引导rna时的活性差异高达200倍。其中，组合12表现最佳，它包含来自nbacas9-2 rec区域3的swap 49以及来自其他宏基因组来源的ii-d型cas9的rec区域2中的一个环。他们将组合12称之为novaiscb。
体外实验显示，novaiscb的有效引导长度增加到15-16 nt。在人类细胞中，novaiscb在使用19-20 nt引导rna时活性最佳，且相比orufiscb-rec，它在使用短于17 nt的引导rna时活性显著降低，进一步提高了特异性。
研究人员将novaiscb与野生型orufiscb和orufiscb-rec在更多靶点上进行了比较。结果显示，novaiscb的indel活性高达约40%，相比之前报道的ogeuiscb活性提高了约100倍。在使用20 nt引导rna时，novaiscb在人类细胞中表现出的脱靶切割特异性与spcas9和ascas12f-yham相当。使用tagmentation-based tag insertion site sequencing (ttiss) 方法，发现novaiscb的脱靶ttiss读数平均为14.3%，而spcas9为10.2%，ascas12f为10.6%。更重要的是，novaiscb的特异性显著高于早期工程化版本的ogeuiscb和eiscb，这两种蛋白的脱靶ttiss读数均高达77.6%。这表明novaiscb在实现高活性的同时，成功维持了高特异性。
“隐身衣”减负：优化ωrna，让递送更轻松
蛋白质工程之外，研究人员还对orufiscb系统的引导rna（ωrna）进行了结构引导的优化。其目标是减小ωrna的尺寸，同时可能通过提高稳定性来增加其表达水平，从而优化系统在有限载货容量（如aav）和低表达环境下的递送效率。基于orufiscb ωrna的低温电镜结构，研究人员锁定了其非结构化的3'末端和5'引导适配器发夹结构进行改造。
他们逐步截短了ωrna的3'末端，发现在体外和人类细胞中，即使截短了高达21 nt，切割活性仍能维持或略有改善。同时，从5'引导适配器发夹的顶部开始逐步截短，发现在与之前验证高活性的orufiscb-krk蛋白结合时，可以去除42 nt（a12-a57区域），而活性没有明显损失。
研究人员将42 nt（5'）和17 nt（3'）的截短（总共移除了59 nt）结合起来，得到了一个更短的166 nt ωrna骨架。当与novaiscb蛋白结合时，这个缩短的ωrna在所有测试的靶点上都表现出强大的活性。此外，这个缩短的ωrna在人类细胞中的表达水平比野生型ωrna骨架提高了大约4倍。总体而言，通过移除多个次级结构，成功减小了ωrna的尺寸，并提高了其表达水平。
一专多能：novaiscb的基因编辑“十八般武艺”
novaiscb的出色表现使其不仅仅局限于产生indel。研究人员进一步探索了它作为通用基因组操作工具的潜力。通过将其核酸酶活性失活（dnovaiscb，d61a/h347a双突变），并与dna甲基转移酶（dnmt3a-3l）和转录抑制结构域（krab）融合，构建了一个可编程的转录抑制系统，称之为omegaoff。这种融合结构（n端dnmt3a-3l，c端krab）与基于cas9的crisproff系统结构类似。
在人类和鼠类细胞中测试发现，omegaoff能够有效抑制多种靶基因的表达，包括临床相关的pcsk9和ttr基因。其抑制水平与基于cas9的crisproff系统相当。通过rna作为omegaoff组分的递送，研究人员也在靶向ascl1和fabp4时实现了强力抑制，最佳抑制效果出现在ωrna与mrna质量比为2:1时。
更重要的是，在靶向fabp4启动子区域进行亚硫酸氢盐测序（bisulfite sequencing）发现，与非靶向ωrna相比，靶向性ωrna在fabp4启动子区域的cpg位点甲基化水平升高。这表明观察到的转录抑制是omegaoff介导的甲基化所致。通过瞬时转染实验，omegaoff的抑制效果可以持续长达21天，这提示改变的甲基化模式可能带来持久的抑制，即使omegaoff表达消失后。
除了抑制，研究人员也将失活的dnovaiscb与vp64, p65和rta（vpr）转录激活结构域融合，构建了omegaon系统，用于基因上调。这个系统也能够显著提高靶基因表达，水平与基于dcas9的crispron系统相似。这些结果共同表明，novaiscb-krk具有介导多种基因组操作模式的灵活性，并且由于其与cas9系统在机制上的相似性，可以利用为cas9优化的系统进行直接的构建设计。
深入体内：aav递送omegaoff，实现持久基因沉默
将novaiscb的紧凑尺寸（614 aa）和优化后的ωrna变体（166 nt）结合起来，意味着可以将融合蛋白和ωrna表达盒打包到一个单一的aav载体中，这为体内递送提供了极大的便利。研究人员利用肝脏嗜性的aav血清型8，将携带omegaoff（基于dnovaiscb）以及靶向小鼠pcsk9启动子的ωrna的载体注射到小鼠体内。pcsk9基因与胆固醇调节密切相关，是潜在的治疗靶点。
注射剂量为每只动物2×10^11总病毒颗粒。以靶向rosa26基因的引导rna作为阴性对照。在注射后采集血液样本，测量血清pcsk9蛋白和总胆固醇水平。
结果令人振奋：从注射后第3周开始，接受pcsk9靶向引导rna的小鼠血清pcsk9水平显著下降。这种下降持续了长达6个月的观察期。类似地，从注射后第4周开始，血清总胆固醇水平也出现了显著下降，并持续了整个研究期间，其降低幅度与临床上使用的pcsk9单克隆抗体所达到的治疗效果范围相似。
为了评估omegaoff的毒性，研究人员在6个月时间点测量了血清总胆红素（bilirubin）和丙氨酸转氨酶（alt）水平，这是肝脏功能的重要指标。结果显示，pcsk9靶向组与未注射组、pbs处理组以及rosa26靶向对照组相比，这些指标没有发生显著变化，提示在该剂量下，omegaoff系统在体内具有较好的安全性。
此外，在人类细胞中的rna测序分析也显示，omegaoff能够以高度特异性的方式抑制靶基因，与crisproff系统表现一致。这些体内外实验结果共同展示了利用omegaoff实现持久基因抑制和表观基因组编辑的巨大潜力。
未来：微型基因编辑工具的新篇章
总而言之，这项研究成功地结合了演化指导和结构引导的工程策略，从自然界中找到并改造了一个紧凑（614个氨基酸）的iscb蛋白——novaiscb，并将其应用于构建紧凑的表观基因组编辑器omegaoff。
从活性最高的天然直系同源蛋白orufiscb出发，通过插入并工程化来自相关蛋白（包括其他iscb和cas9）的rec结构域，成功地增加了novaiscb的有效引导长度，使其最优使用20 nt引导rna。与野生型orufiscb相比，novaiscb实现了高达约40%的indel活性（提高了约100倍）。更重要的是，通过精心的rec环工程和ωrna优化，novaiscb在保持高活性的同时，其脱靶特异性也达到了与spcas9和ascas12f-yham等成熟系统相媲美的水平，显著优于早期的工程化ogeuiscb或eiscb。
novaiscb的紧凑尺寸（614 aa）和优化后的ωrna（166 nt）使其能够被打包到单一的aav载体中，极大地促进了体内递送。研究人员展示了基于dnovaiscb的omegaoff系统在小鼠体内通过aav递送，能够实现长达数月的持久基因抑制，并伴随表观遗传修饰。这不仅为体表观基因组编辑提供了新的高效工具，也为未来开发更紧凑、更安全的基因治疗方法奠定了基础。
当然，novaiscb目前主要识别ntaaa tam，这虽然能够靶向90%的人类基因进行敲除和93%的基因启动子区域进行转录调控，但未来扩展其tam兼容性或提高对非规范tam的靶向效率将使其应用更加广泛。同时，评估novaiscb以及其他基于iscb的基因编辑工具在体内的免疫原性，是将其推向临床应用的关键下一步。
这项研究成功地将自然多样性筛选、结构生物学、蛋白质工程和深度学习预测相结合，创建了一个性能显著提升的iscb变体。这一策略不仅为优化基因编辑工具提供了范例，也为通过工程化改造天然酶类，用于分子生物学应用开辟了新的可能性。novaiscb作为基因编辑工具箱中的新成员，有望在疾病研究、基因治疗等领域发挥重要作用，解锁更多生命科学的奥秘。

参考文献

kannan, s., altae-tran, h., zhu, s. et al. evolution-guided protein design of iscb for persistent epigenome editing in vivo. nat biotechnol (2025). https://doi.org/10.1038/s41587-025-02655-3

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