引言
胞嘧啶碱基编辑器(CBEs)是引入C-T碱基转换的有效工具，但其临床应用受到脱靶效应和旁观者效应的限制。
2024年3月29日，华东师范大学李大力、王立人及上海交通大学曾凡一共同通讯在Nature Chemical Biology 在线发表题为“Engineering APOBEC3A deaminase for highly accurate and efficient base editing”的研究论文，该研究开发了一种工程APOBEC3A脱氨酶，用于高精度和高效的碱基编辑。通过人类APOBEC3A (A3A)脱氨酶的结构引导工程，该研究开发了高度精确的A3A-CBE (haA3A-CBE)变体，该变体有效地产生C-to-T转换，具有狭窄的编辑窗口和接近背景水平的DNA和RNA脱靶活性，而不考虑甲基化状态和序列背景。
工程脱氨酶结构域与PAM松弛的SpCas9-NG变体兼容，通过单导RNAs的灵活定位，能够精确校正同聚胞嘧啶位点的致病突变。双腺相关病毒将一种haA3A-CBE变体递送到酪氨酸血症小鼠模型中，在肝组织中诱导高达58.1%的编辑，并伴有最少的旁观者编辑，通过单剂量的脂质纳米颗粒信使RNA递送haA3A-CBE进一步降低了这一水平。这些结果凸显了haA3A-CBEs在精确基因组编辑治疗人类疾病方面的巨大前景。
碱基编辑是一项革命性的技术，它能够在分裂和非分裂细胞中有效地将一个碱基对转化为另一个碱基对，而不需要双链DNA断裂或供体模板。有两种主要类型的碱基编辑器：腺嘌呤碱基编辑器(ABEs)和胞嘧啶碱基编辑器(CBEs)，它们分别诱导高效率的A-to-G和C-to-T转换。ABEs通常催化碱基转化，产物纯度非常高(>99.9%)，而CBEs通过胞嘧啶脱胺作用产生尿嘧啶，从而刺激尿嘧啶DNA糖基化酶产生基位，激活细胞碱基切除修复途径，将胞嘧啶转化为胸腺嘧啶和其他核苷酸。
为了提高CBEs的产品纯度，使用尿嘧啶糖基化酶抑制剂(UGI)与nCas9和各种胞苷脱氨酶结构域融合，开发出具有高C•G-to-T•A产品纯度的CBEs。此外，一些研究小组还开发了C-to-G碱基编辑器，利用尿嘧啶DNA糖基化酶替代CBE中的UGI，或仅在CBE结构中使用进化的胞苷脱氨酶变体，有效地生成C•G-to-G•C转换。这些碱基编辑器已广泛应用于动物基因工程、植物基因工程，并在基因治疗中显示出良好的潜力。然而，一些研究报道了CBEs的脱氨酶结构域诱导Cas9非依赖性DNA和RNA脱靶突变，这可能会阻碍CBEs在精确编辑方面的广泛应用，特别是在临床环境中。此外，由目标位点上不希望的碱基转换引起的旁观者效应也可能对精确编辑构成挑战。
已经实施了几种策略来提高碱基编辑器的准确性，包括缩小编辑窗口或募集具有定义序列上下文的脱氨酶变体。截断脱氨酶CDA1或缩短nCas9与脱氨酶结构域之间的连接可以适度缩小编辑窗口。此外，一些在特定序列背景下优先脱氨胞嘧啶的脱氨酶的工程设计导致了eA3A-CBE和A3G-CBE的发展，它们分别催化TC和CC基序中的C-to-T转化。特别是对于eA3A-CBE，由于限制基序偏好，旁观者编辑量大大减少，效率高，脱靶效应最小。rAPOBEC1脱氨酶的蛋白质工程已经产生了CBE变体，如YE1，FE1和R33A，这些变体显示出狭窄的编辑窗口和显著减少脱靶效应。变形式碱基编辑器具有最小的脱氨酶诱导的脱靶效应，但该系统应用复杂，旁观者编辑效果仍未得到改善。
A3A的进一步工程开发haA3A-CBE（Credit: Nature Chemical Biology）
该研究在细胞系和人类疾病动物模型中证明了haA3A-CBEs在纠正各种序列背景下的致病性 SNVs方面的显著效率和精确性。使用PAM松弛的SpCas9-NG结合灵活的sgRNA设计进一步提高了haA3A-CBEs校正人类致病性 SNVs的准确性。值得注意的是，大量与疾病相关的T-to-C突变存在于CpG二核苷酸中，CpG二核苷酸通常被甲基化，或者存在于GC基序中。haa3a -CBE特别适合于纠正这些类型的突变，使它们成为治疗人类疾病的有希望的候选者，并将CBE工具箱扩展到各种应用中。
华东师范大学生命科学学院博士后杨磊，博士研究生霍雅楠，硕士研究生王嫚（现为东南大学博士研究生）以及博士后张丹为该论文的共同第一作者，华东师范大学为第一单位，华东师范大学李大力研究员，王立人副研究员和上海交通大学基础医学院曾凡一为本文通讯作者。华东师范大学生命科学学院刘明耀教授，宋高洁研究员、程义云教授、吕佳研究员、关玉婷研究员、北京大学伊成器教授及香港中文大学冯波教授等对本项研究提供了重要支持。
原文链接
https://www.nature.com/articles/s41589-024-01595-4
责编|探索君
排版|探索君
文章来源|“iNature”
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