最新！浙江大学全力打造snRNA-seq平台，揭示癌症研究新靶点！

2023年05月13日19:34:09 科学 1295

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作者：Alan

导读：FFPE组织构成了一个巨大而有价值的临床病史和随访数据的患者信息库，然而在组织中获得单细胞/细胞核rna (sc/snRNA)谱仍然具有挑战性。

5月12日，浙江大学研究人员在《Nature:Communications》上发表了名为“High-throughput single nucleus total RNA sequencing of formalin-fixed paraffin-embedded tissues by snRandom-seq”的文章，研究人员为临床FFPE（福尔马林固定和石蜡包埋）标本提供了一个强大的snRNA-seq平台，可在每个细胞核中检测到超过3000个基因，并鉴定出25种典型的细胞类型，并有望在生物医学研究中得到广泛应用。

https://www.nature.com/articles/s41467-023-38409-5

研究背景

常规的福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)组织是最常见的可归档标本，构成了一个庞大而有价值的患者资料库，包括临床病史、随访资料等。然而不可避免的是，福尔马林固定在FFPE样品中的大分子上所引起的不可逆修饰总是给分子生物学应用带来挑战。近年来，通过优化RNA提取方法或空间原位分析在FFPE样本的转录谱分析方面取得了很大进展。高通量单细胞/细胞核RNA测序(scRNA/snRNA-seq)方法彻底改变了整个生物医学研究领域。研究人员利用定制的高通量scRNA-seq平台构建了首个人类和小鼠细胞图谱。临床FFPE标本中每个细胞的准确转录组学特征能够更好地了解细胞异质性和群体动态，提高人类疾病的精确诊断、治疗和预后。然而由于RNA交联、修饰和降解，从FFPE组织中分离单个完整细胞/细胞核和捕获RNA仍然具有挑战性。

研究方法

为克服这些挑战，研究人员从不同的角度开发了各种方法。SMART-seq-total9和VASA-seq10通过使用poly(A)跟踪所有RNA分子捕获聚腺苷化和非聚腺苷化转录本。另一方面，SPLiT-seq11也被报道成功地用于固定细胞，使用随机引物更有效和更广泛地捕获RNA。然而这些方法尚不适用于FFPE组织。在实践中，总是需要对临床标本进行大规模和全面的转录组学分析，以确定预测性生物标志物或罕见细胞类型。因此，研究人员目标是找到一种能够满足FFPE组织高通量、高灵敏度和高覆盖snRNA-seq需求的方法。

在这项研究中，研究人员开发了snRandom-seq，这是一种基于液滴的FFPE组织高灵敏度和全长snRNA测序方法。通过使用随机引物捕获总rna进行逆转录，并通过在第一链cDNA上进行poly(dA) tail合成第二链。同时也开发了一种在温和条件下分离FFPE组织中单个完整细胞核的方法，包括脱蜡、再水化和核提取。此外，研究人员还设计了单链dna阻断步骤，避免基因组污染的影响。通过使用人类-小鼠混合样本来验证snRandom-seq的性能，结果显示轻微的重偶率(0.3%)，与最先进的高通量scRNA-seq技术相当。在FFPE小鼠组织中，snRandom-seq在snRNA测序和细胞类型注释方面结果乐观，其中snRandom-seq在约20,000个单个细胞核中检测到每个细胞核中多于3000个基因，并鉴定出25种典型的细胞类型(肝细胞，生殖细胞，成纤维细胞，心肌细胞等)。此外，将snRandom-seq应用于临床FFPE人肝癌标本，并揭示了具有高增殖活性的细胞核亚群，这可能是癌症研究的潜在靶点。总之，snRandom-seq为实验室和临床FFPE标本提供了一个强大的snRNA平台，并在生物学研究和临床实践中具有广泛的应用前景。

https://www.nature.com/articles/s41467-023-38409-5

snRandom-seq的主要工作流程如图1所示。对于FFPE组织的单核分离，首先选择储存的FFPE组织块区域并放入管中。用标准二甲苯和酒精洗涤进行脱蜡和复水化。之后，细胞核被解离并渗透。在全面和高通量的单核总rna测序方面，研究人员提供了一种基于随机引物的化学捕获=总rna的策略以及一种易于操作的基于液滴的单核标记平台。细胞核分裂成不同的管，用预索引的随机引物逆转录，然后汇集在一起进行后续反应。研究人员也在之前工作的基础上建立了高通量单核条形码的微流控平台。聚(dT)引物通过酶切从液滴中释放出来，同时，DNA通过RNA降解从细胞核中释放出来。然后聚(dT)引物与cdna末端的聚(dA)尾部结合并延伸，在每个液滴中为cdna添加特定的条形码。条形码完成后破坏液滴，扩增条形码cDNA，并制备下一代测序(NGS)文库用于配对端测序。

研究意义

在这里，研究人员开发了一种基于液滴的FFPE组织snRNA测序技术(snRandom-seq)，通过随机引物捕获全长总rna。与目前最先进的高通量scRNA-seq技术相比，snRandom-seq显示出较小的双偶率(0.3%)，更高的RNA覆盖率，并且检测到更多的非编码RNA和新生RNA。

为实验室和临床FFPE标本提供了一个强大的snRNA平台，并在生物学研究和临床实践中具有广泛的应用前景。

参考资料：

https://www.nature.com/articles/s41467-023-38409-5

注：本文旨在介绍医学研究进展，不能作为治疗方案参考。如需获得健康指导，请至正规医院就诊。