今天推送的文章发表在J Agric Food Chem.上的“Crystal Structure of Levansucrase from the Gram-Negative Bacterium BrenneriaProvides Insights into Its Product Size Specificity”，作者为江南大学食品学院的沐万孟教授。
果聚蔗糖酶属于糖苷酶68家族(GH 68)，在G+和G−细菌的蔗糖利用过程中起关键作用。LSs从蔗糖中合成主要通过β-(2，6)果糖键形成的果聚型低聚果糖(FOS)和果聚型聚合物。值得注意的是，与来自G-细菌的酶相比，从G+细菌中分离的LS酶产生更长的果聚糖作为其主要产物。
LSs采用的机制包括断裂蔗糖的α1-β2糖苷键并将其果糖基单元转移到含有果糖基的受体（转果糖基化，缩写为T反应）或水（水解，缩写为H反应）。除了细胞壁组成以及酶和底物浓度等环境条件外，LS酶本身中底物位点的空间组织部分决定了T和H反应之间的比率(T/H)，因此也决定了最终产物的长度。迄今为止，仅发表了少数几个LSs的3D结构；两个G+细菌包括来自B.subtilis和Bacillus megaterium的LSs，以及三个G−细菌，包括来自G.diazotrophicus，E.amylovora和Erwinia tasmaniensis的LSs。它们都采用共同的五叶片β螺旋桨作为其催化域，而主要区别在于连接叶片内部和叶片之间的β链的环。一个深的带负电荷的口袋位于β-螺旋桨结构域的底部，用于蔗糖结合。作为G+细菌LS的代表，Bs-SacB(E324A)与蔗糖的复合物在−1和+1亚基周围有3个催化残基D86、D247和E342，分别被指定为亲核剂、过渡态稳定剂和一般酸碱。
蔗糖结合位点(−1和+1亚位)周围的某些残基的突变会降低酶的活性和产物的合成。此外，距离活性位点较远的残基的突变也会影响产物谱，例如Bacillus megateriumLS(Bm-LS)的突变体Y247A、Y247W、N252A、D257A和K373A。事实上，在最近的一项研究中，通过酶(D86A/E342A突变体)与果聚型FOS(6，6，6，6，6，6，6-酮辛糖)的共结晶复合体观察到了Bs-SacB中远程果聚FOS结合位点(OB1和OB2)的影响。Bs-SacB中+2，+3和+4亚基附近残基的突变只是减小了低分子质量（LMW）果聚糖的大小，而不是HMW果聚糖大小。这进一步支持了解LS产物大小特异性的潜在机制对于实现定制的果聚糖合成的相关性。
为了更深入地了解Brs-LS的产物专一性和LSs的结构−功能关系，特别是关于产物大小的特异性，作者对Brs-LS突变体H327A和A154S的产物谱进行了更详细的分析。此外，还测定了野生型Brs-LS、突变体H327A、A154S以及与供体底物蔗糖形成的复合体的失活突变体(D68N)的晶体结构，这是首次对G−-LSs进行结构表征。这些结构证实了残基A154和H327在Brs-LS合成聚合物中的重要作用，表明它们的突变是如何影响酶活性部位附近的基本相互作用的。
H327A和A154S的产物谱
HPLC分析表明，与野生型Brs-LS相比，A154S突变体能够产生HMW果聚糖(图1)。在该图中，包括多糖以及果聚糖的寡糖作为产物。事实上，A154S突变体产生的多糖的Mw约为106−107Da，比Brs-LS宽一点。令人惊讶的是，突变体H327A未能产生任何HMW果聚糖；甚至蔗糖浓度增加到60%。当反应达到平衡时，除了蔗糖、葡萄糖和果糖外，还会生成一系列聚合度较低的FOS(DP≤6)。H327A突变体合成的果寡糖主要是三糖6-酮糖，是最简单的Levan型FOS。
Brs-LS的晶体结构
Brs-LS的晶体结构采用典型的GH68折叠；与先前构建的同源模型(20)叠加表明，除了一些外环外，它们非常相似。Brs-LS的球形催化结构域由残基64−422组成，是一个5叶β-螺旋桨结构(图2a，b)，这是GH68家族酶的典型结构特征。每个叶片由四条反平行的β链(称为A−D)组成；有时，C或D链被分成两条短的β链。叶片形成一个漏斗，在Brs-LS的底部有一个很深的口袋(图2c)，其中有三个建议的催化残基D68、D225和E309。活性中心漏斗的内壁主要排列着每个叶片的第一条和第二条β链，而催化结构域的外部主要由每个叶片的第三条和第四条β链组成。活性部位漏斗的边缘由来自四个结构元件的残基排列：(A)连接链1B-1C的环中的螺旋α1(环1)，(B)连接链2D-3A的环4，(C)连接链4B-4C的环7，以及(D)连接链5B-5C的环9。
Brs-LS结构更类似于G−细菌LS，而不是G+细菌LS。与Brs-LS最接近的结构同系物是G−细菌Ea-LS和Et-LS。事实上，所有次级结构元素几乎完美地叠加在一起，连接环和环的长度也非常相似(图3a)。与Ea-LS相比，在漏斗内的环路中，Brs-LS中有五个残基不同：N116、Y220、A222、F329和Y371，分别取代了E94、F198、N200、T307和F349(图3b)。Brs-LS与代表G+细菌LSs的Bs-SacB和Bm-LS的叠加显示出更显著的差异，主要发生在连接每个叶片内和之间的β链的环中，以及包括漏斗边缘的元件(图3c)。
活性部位(野生型)
活性中心(−1和+1)位于β-螺旋桨催化结构域的中心，形成一个深口袋，容纳多个水分子和−1亚基中的甘油分子。从序列比对和活性分析来看，位于叶片1(D68)、3(D225)和4(E309)的第一β链上的三个残基先前被确认为Brs-LS的催化三联体。催化残基参与了一个广泛的氢键网络，涉及几个水分子、甘油以及残基R224、R310、Y374和S375。残基S375具有双重构象，可以与R310相互作用，也可以与催化亲核试剂D68相互作用。催化酸碱E309也呈双构象。在催化三联体的5 Å范围内，存在另外6个残基(W67、W153、A154、Q307、I325和H327)(图4a)。这些残基相对于其他G-细菌的LS，包括Gd-LS和Ea-LS，在残基类型和构象方面是保守的。相反，与G+细菌LSsBs-SacB和Bm-LS相比，Brs-LS中这六个位置中有四个位置不同：A154(G+LS中的丝氨酸)、Q307(谷氨酸)、I325(天冬氨酸)和H327(精氨酸)(图4b)。
活性部位(突变体D68N与蔗糖复合)
Brs-LS的D68N突变体对蔗糖无活性。来自浸泡了50 mM蔗糖的晶体的2Fo-Fc和Fo-Fc电子密度图(1.35 Å分辨率)表明活性中心中存在蔗糖，尽管果糖基环的密度不太明确；因此，蔗糖占有率被设置为0.70以获得最佳的精制结果。Polder类型的omit图(图5a)证实了底物的存在。Brs-LS蔗糖复合物与BsSacB(PDB：1PT2)的重叠显示出几乎相同的结合方向。底物的果糖和葡萄糖部分通过几个直接氢键作用与酶紧密结合。详细地说，果糖基的O1/与两个D68N侧链构象之一的Oδ1发生氢键作用，而O3和O4羟基通过D225 Oδ1和Oδ2的氢键稳定。突变的催化亲核试剂(D68N)的另一个侧链构象从蔗糖指向A154和R310，但没有发生任何氢键作用。值得注意的是，糖苷氧以及葡萄糖O2和果糖O/通过氢键与E309相互作用，将这种催化酸/碱放置在合适的方向上，向糖苷键提供质子。E309侧链的取向通过与R224和Y374的氢键相互作用进一步稳定，这两个残基都是保守的残基。在D68N突变体中没有观察到其他显著的结构变化。
除催化残基外，其他残基包括W67、H119、R224、Q307、H327和S375以及A154的主链氮原子也与蔗糖相互作用(图5b)。在这些残基中，涉及W67、R224、D225和S375的相互作用与Bs-SacB蔗糖复合体结构保守；这些残基分别位于高度保守的基序-VWD-、-RDP-和TYSH中。另外两个残基Q307和H327不同于G+细菌LS中发现的残基(例如Bs-SacB的E340和R360)，与BsSacB中的情况相似，它们仍然与蔗糖的葡萄糖部分的O2和O3基团提供氢键相互作用。
突变体H327A
将野生型Brs-LS和突变体H327A的结构叠加，RMSD值为0.078 Å，表明这两种结构之间有很高的相似性。H327组氨酸环的存在有助于形成漏斗的这一侧(图6a)，从而定义底物结合空间，并可能影响果糖转移效率。值得注意的是，虽然在野生型结构中，H327被“夹在”Y374和F329的内向构象之间，但H327A突变体缺乏杂环组氨酸环，π−π堆积相互作用不再可能。结果，在突变体H327A中，只观察到F329的外向构象(图6b)。总而言之，组氨酸环的缺乏和苯丙氨酸的首选向外构象导致了+1亚位附近更宽的空间(图6c)。
突变体A154S
野生型Brs-LS和A154S突变结构的叠加，RMSD为0.105 Å。值得注意的是，在突变结构中，观察到了S154的两种不同构象(图7)。两个Ser侧链构象中的一个与过渡态稳定残基D225(以及与水W149)产生氢键；另一个S154侧链构象参与与D68 OD2的氢键作用，从而略微重新定位其侧链(0.5 Å OD2)。值得注意的是，与D68N蔗糖复合体不同，D68侧链具有单一构象，面向−1亚基。最后，A154S的主链氮原子与甘油的O3原子发生氢键作用；在野生型和H327A结构中，水分子处于同一位置，而在D68N蔗糖络合物中，氢键作用是与果糖基O4/。
整理：孙骁
文章信息：
DOI：10.1021/acs.jafc.2c01225
文章链接：https://doi.org/10.1021/acs.jafc.2c01225
