遗传密码的错误翻译，称为误译，在传统上被认为是不利于细胞生长和生存的。但已证明生物故意错误翻译遗传密码以应对压力，且越来越多的证据表明，许多微生物病原体可以故意错误翻译其遗传密码，以帮助入侵宿主或逃避宿主的免疫反应，已在越来越多的微生物病原体中发现了错误翻译。这种故意错误翻译不是随机的，通常是仅限于一种特定类型的翻译错误，这种错误是由于存在一种不寻常的、专用的蛋白质合成因子，赋予生物体故意改变遗传密码规则的能力。由于缺乏识别自然界中异常翻译因子的通用策略，使病原生物中错误翻译的研究受到阻碍。
最近报道的研究中，作者通过研究编码氨酰-tRNA合成酶（aaRS）基因的副本以发现故意错误翻译，从而解决了上述问题，该成果发表于《PNAS》。
植物病原性链霉菌编码不寻常的ProRS亚型
在细菌中，脯氨酰-tRNA合成酶（ProRS）有两种亚型，它们执行相同的基本功能，但具有不同的结构和结构域排列。但最近，人们发现了第三种ProRS，命名为ProRSx。通过BLAST比对发现，ProRSx主要出现在4个链霉菌属中，但它们都对几种农作物构成威胁，主要是马铃薯。在蛋白结构上，ProRSx与细菌型ProRS具有相同的结构域组织，这表明ProRSx可能是通过链霉菌中细菌型ProRS基因的复制进化而来的。然而，ProRSx序列与细菌型ProRS又存在显着差异，尤其是识别tRNAPro反义密码子的C端结构域，缺乏细菌型ProRS特征基序（图1B）。
ProRSx的两侧是具有多种特征元素的不寻常脯氨酸tRNA基因
为了深入了解ProRSx的可能功能，作者分析了链霉菌属物种中ProRSx基因的基因组背景。有趣的是，作者发现ProRSx由一个保守的操纵子编码，并且包括一个与ProRSx相邻的tRNA基因。作者对该tRNA基因的二级结构进行预测分析（图3A），发现该tRNA具有高度非典型结构。它具有丙氨酸反密码子AGC，但它缺少tRNAAla特有的G3:U70碱基对，却有脯氨酸tRNA特征元件C1:G72碱基对。由于混合了这些特征元素，作者将tRNA该命名为tRNAProA。因为tRNAProA混合多种特征，作者接下来测试了tRNAProA是否可以与典型的ProRS或AlaRS发生交叉反应。使用体外氨酰化实验表明，典型的ProRS或AlaRS无法氨酰化tRNAProA。这些数据以及tRNAProA和ProRSx基因的共定位表明tRNAProA只是ProRSx底物。
在大肠杆菌中共表达S.turgidiscabies的ProRSx和tRNAProA导致丙氨酸错译成脯氨酸
为进一步研究研究S.turgidiscabies ProRSs在细菌中的功能活性，作者接下来建立了一个温度敏感实验方案。作者采用温度敏感型的大肠杆菌菌株UQ27,其ProRS在42°C下将失活，细菌将会死亡，但能被携带完整功能ProRS基因的质粒补救。实验结果表明，在42°C下，ProRSx无法补救UQ27菌株，即ProRSx无法氨酰化大肠杆菌中的tRNAPro。作者接下来试图直接在体外测试tRNAProA是否可以被ProRSx氨酰化。但在原核表达的过程中ProRSx形成包涵体，因而无法获得有活性的ProRSx。为了解决这个问题，作者开发了一种高度敏感的替代方案来测定大肠杆菌细胞中的ProRSx和tRNAProA活性。该测定方法基于β-内酰胺酶报告基因，若其第65位保守的Pro残基替换为Ala会大大削弱β-内酰胺酶的活性，因此可以用于监测GCU丙氨酸密码子与脯氨酸的错误翻译（Ala→Pro错误翻译）（图4A）。实验结果表明，ProRSx可以用脯氨酸氨酰化tRNAProA，导致用脯氨酸解码GCU丙氨酸密码子。
ProRS-Ec-5ABD对tRNAProA的体内氨基酰化导致丙氨酸密码子的错误翻译
作者接下来试图了解tRNAProA如何避免与典型的ProRS发生交叉反应，但仍对ProRSx保持特异性。
在T.thermophilus中，ProRS识别tRNAPro主要依赖于K353,D354,E340,R347和K369五个保守残基，但在ProRSx中均发生突变。因此，作者根据ProRSx的序列将大肠杆菌的ProRS进行点突变，获得大肠杆菌ProRS(ProRS-Ec-5ABD)的突变体。实验结果发现，ProRS-Ec-5ABD保留了大肠杆菌的氨酰化典型tRNAPro的能力，同时还获得了用脯氨酸氨酰化tRNAProA的能力（图5C和D）。
为了便于定量，作者建立了一个检测方案，该方案基于绿色荧光蛋白GFP和红色荧光蛋白mCherry之间的嵌合蛋白融合（图6A）。前人的研究表明，用脯氨酸替代第65位的丝氨酸会削弱GFP荧光，但用丙氨酸替代则会产生有荧光的GFP。因此可以通过比较GFP和mCherry荧光强弱即可判断是否发生错误翻译。通过质谱分析表明，表达ProRS-Ec-5ABD和tRNAProA的细胞在GFP/mCherry报告蛋白中确实含有Ala→Pro突变（在GFP位置65）。相比之下，在不表达tRNAProA的情况下表达ProRS-Ec5ABD的细胞仅包含野生型的GFP（图6D）。
ProRS-Ec-5ABD和tRNAProA的错误翻译抑制细胞生长
最后，作者使用ProRS-Ec-5ABD来评估蛋白质组范围内丙氨酸密码子的错误翻译如何影响细菌适应性。作者观察到，当单独表达tRNAProA或ProRS-Ec-5ADB都对大肠杆菌的生长没有毒性。然而，当tRNAProA和ProRS-Ec-5ADB同时表达时，大肠杆菌的生长明显受到抑制，这进一步表明两者可能是共同进化的产物。
总结
作者以细菌脯氨酰-tRNA合成酶(ProRS)基因为例，鉴定了一种异常的ProRS亚型ProRSx和相应的tRNA--tRNAProA，它们主要存在于来自链霉菌属的植物病原体中。然后作者发现tRNAProA具有不寻常的混合结构，允许此tRNA将丙氨酸密码子错误翻译为脯氨酸。最后，作者提供了生化、遗传和质谱证据，表明表达ProRSx和tRNAProA的细胞可以将GCU丙氨酸密码子翻译为丙氨酸和脯氨酸。由于蛋白质序列中的随机Ala→Pro突变，这种丙氨酸密码子的双重使用创造了隐藏的蛋白质组多样性。这一发现揭示了天然tRNA合成酶/tRNA用于有义密码子专用错误翻译的最初例子。
原文链接：
https://www.pnas.org/content/118/35/e2110797118
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