MALDI-TOF MS 在微生物鉴定中的重要应用及挑战

来源：小桔灯网

作者：quite

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS) 是应用于临床微生物检验领域的一种新技术。这一技术的出现为准确地鉴定细菌、真菌和分枝杆菌提供了良好的工具。欧洲微生物实验室首先开始使用MALDI-TOF MS。由于其简便、高准确性、快速周转时间和低成本等优点，使得该技术在全球微生物实验室被广泛采用。得益于质谱技术在微生物鉴定方面的飞速发展，国内研究学者们也逐渐重视MALDI-TOF MS在微生物领域的应用。

历史和发展

虽然在1975年已首次提出将质谱用于细菌鉴定，然而当时采用的电离方法会使蛋白质片段化，所以阻碍了其有效分析的能力。20世纪80年代，有两个团队提出了类似的想法来检测完整的大分子，一起发明了用MS研究完整田中耕一(Koichi Tanaka) 及蛋白质的技术。其同事发明了一种使用混有甘油的超细金属粉末来分析生物大分子且同时不破坏大分子的方法。为此，田中耕一被授予诺贝尔化学奖(与John Fenn和Kurt Wiith rich共享) [2]田中耕一发表研究的同时， Franz Hillen kamp和Michael Karas发表了使用有机化合物基质烟酸进行软解吸电离来分析生物大分子的研究[3]基质辅助激光解吸电离(matrix-assisted laser desorption MALDI) 这一术语亦来源于此。2006年，Fox在Journal of Clinical Microbiology上发表了第一篇有关质谱技术在临床微生物应用的文章，引起同行关注，他认为该技术鉴定细菌还有许多技术难题要克服，不易成为常规方法，但是2009年后微生物质谱技术迅速风靡欧洲、北美和亚洲的一些国家。基质辅助激光解吸电离离子源和飞行时间质量分析器质谱(matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS)技术吻合了微生物专家的期待：操作简单、鉴定迅速、低运行成本及自动更新的数据库。在微需氧菌、厌氧菌、真菌及分枝杆菌等难培养微生物鉴定方面表现尤为突出，鉴定时间由数天推进到以分钟和秒计算。新开发项目更是令人鼓舞，如无菌体液的直接鉴定、耐药表型识别、致病毒素分析以及医院感染病原体遗传溯源等。

相关国标与指南

行业内的朋友们都知道，质谱在临床领域的一大问题就是缺乏标准化和规范化。但是MALDI TOF MS相对而言其标准和共识还是比较全面的。

国标 《GB/T 33682-2017 基质辅助激光解析电离飞行时间质谱鉴别微生物方法通则》

《MALDI-TOF MS病原体鉴定质量保证专家共识》

《MALDI⁃TOF MS在临床微生物鉴定中的标准化操作专家共识》

《临床微生物学实验室建设基本要求专家共识》

《中国核酸质谱应用专家共识》

《中国临床微生物质谱应用专家共识》

《自建MALDI-TOF MS微生物鉴定数据库专家共识》

待发布卫生标准 《临床微生物检验基本技术要求》

临床应用

耐药性检测

微生物实验室不但要提供精确的病原菌鉴定结果，同时还要检测其敏感性，为临床医生提供治疗依据。常规的药物敏感性试验方法比较费时， 一些酶联免疫、凝集等方法只能局限于少数细菌。MALDI-TOF MS可为耐药基因检测提供一个很好的平台，可以分析几乎所有的耐药机制，目前报道的方法主要基于下列几种原理：分析抗菌药物及被修饰后的产物；分析细胞组分；分析核糖体DNA甲基化；检测突变等。

流行病学

微生物实验室、感染控制人员和临床医师面临的挑战之一是在某个临床菌株暴发流行时可以得到菌株代表分类的特异数据，如沙门菌、链球菌等，为了准确得到血清型、亚型或其它分类，实验室必须耗费更多的时间做进一步检测，而且许多菌株分型需要特殊的试验方法、仪器、耗材等。因此，条件有限的实验室就需要外送做检测，可能导致检测时间延长、丢失重要的流行病学数据、增加检测费用、结果不准确等。但如果在微生物实验室内快速、准确完成重要数据的结果将会帮助临床医师、护士、感控人员和卫生机构处理、追踪感染病原菌并掌握其流行状况。

目前，通过大量菌株的群、属、种分析，以及许多菌株分型研究的深入，MALDI-TOF MS所具备的鉴定这些高度相关菌株的能力将使临床微生物实验室的影响力提升。将来可能出现更加精密的MALDI-TOF MS仪器，不但可以鉴定病原菌，同时可以快速、准确地提供菌株的流行病学数据，这将使临床微生物实验室在医院感染控制、病原菌暴发、耐药菌国家监测及生物防御等领域扮演重要角色。

常见细菌的鉴定

常规微生物鉴定主要基于生化反应、显微镜检、免疫学或者分子生物学。这些分析方法专业知识要求较高，并且费时费力。等待结果期间临床医师会经验性使用抗菌药物，然而有时是不合适或者错误的。现代临床微生物实验室需要快速、可靠和经济的方法来鉴定细菌，以便及早进行适当的抗菌药物治疗。质谱技术将微生物鉴定从24~48h缩短到数分钟，而且仅需分析极少的菌量（104~106 CFU/mL）。以16SrRNA基因测序结果为标准，质谱仪正确鉴定率为90.0%~95.0%，远高于以往的商业自动化鉴定系统。

获NMPA认证的企业一览

近几年，国内在MALDI-TOF MS仪器的研发与生产快速起步，涌现了一批科研人员和企业，大大推动了MALDI-TOF MS国产化的进程。MALDI-TOF MS将可能成为首个由中国企业掌握最领先核心技术，并引领技术发展的质谱仪品类，这对我国在生物大分子分析研究、临床分子诊断应用等方面有极大的推动。由数据可看到，2020年到现在新获批的国产飞行时间质谱达9家。

挑战

质谱鉴定的准确性依赖于菌种数据库的质量，菌种数据库信息不全将会限制鉴定准确性，丰富菌种数据库将有利于鉴定结果的准确性。虽然自建数据库可以提高鉴定率，但是耗时，需要专业技术人员及真菌学专家指导。此外，体外诊断认证的数据库并不允许随意增加，因此只能用于科研。其次，虽然MALDI-TOF MS能快速有效地鉴定细菌，但其对后续的抗菌药物敏感试验的指导意义还存在诸多争议。

尽管MALDI-TOF MS所得到的结果一般是可重复的，但也有变化的可能。质谱仪（不同类型及单个仪器、仪器年龄、仪器配置）、基质和溶剂组成、制备方法、技术人员培训和能力、培养条件（如培养基、菌株培养的时间和温度）和生物学变异都可能影响其结果。所以，其规范化质量控制策略仍需要被制定。另外，分离好的菌落必须经过检测，如果菌落没有很好地被分离，则有可能有多种微生物存在，而占比少的菌种可能不被发现。

引用：

[1] FoxA. Mass spectrometry for species or strain identification after culture or without culture: past, present, and future[J]. J Clin Microbiol, 2006,44:2677-2680.

[2] 曹书娟, 刘彬, 朱安娜. MALDI-TOF MS在药物基因组学检测中的应用及展望[J]. 分子诊断与治疗杂志, 2020, v.12;No.65(01):121-125.

[3] 罗燕萍. 质谱技术在临床微生物实验室中的应用前景[J]. 检验医学, 2015(2):97-101.

[4] 田月如, 关明, 李敏. MALDI-TOF MS技术在临床微生物诊断应用中的挑战[J]. 中华检验医学杂志, 2018(8):559-562.