临床容易受到病菌侵蚀，但抗菌药物广泛使用，让有些疾病难以治愈

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铜绿假单胞菌(PA)是临床最重要的条件致病菌之一，可以引起肺部、皮肤软组织、血液和泌尿系统等多个部位的感染。

全国和本院2019年的细菌耐药监测报告都显示，PA的临床分离率在革兰阴性致病菌中排第3位，约占12%。

随着抗菌药物的广泛使用，强大的环境选择压力导致了PA的耐药机制越来越复杂和多样，包括产酶、药物作用靶位改变、主动外排机制、膜通道蛋白缺失和生物膜形成等。

其中生物膜一旦形成，PA就很难被彻底清除，这是导致临床出现难治性、慢性感染病例的重要原因。

治疗生物膜相关感染时，医生往往会联合使用敏感且膜渗透性能好的抗菌药物，除了及时清除播散性细菌，还可以降低感染部位的生物膜负载。

但是由于细菌耐药性的增加，尤其是多重耐药菌株的逐渐增多，抗菌药物在体内的浓度常常达不到最低抑菌浓度(MIC)，即处于亚抑菌浓度状态。

此状态下，对于临床常用抗菌药物联合对PA生物膜的作用效果还缺少系统性评价。

本研究旨在以临床黏液型多重耐药PA菌株为对象，比较在1/2MIC亚抑菌浓度时，6种临床常用抗菌药物联合使用对其生物膜的体外抑制效果。

收集2020年10月至2021年3月本院临床微生物室分离的黏液型多重耐药PA菌株6株。

细菌鉴定和药敏试验采用法国生物梅里埃VITEK2Compact全自动细菌鉴定及药敏分析系统，多重耐药的判定标准为对3类或3类以上临床常用抗菌药物不敏感。

菌株使用含15%甘油的无菌肉汤-80℃保存。

复苏PA菌株，统一采用CLSI推荐的微量肉汤稀释法检测哌拉西林/他唑巴坦(TZP)、头孢他啶(CAZ)、氨曲南(ATM)、亚胺培南(IPM)、左氧氟沙星(LVX)和庆大霉素(GEN)6种抗菌药物的MIC，质控菌株为铜绿假单胞菌ATCC27853。

TZP购自海南通用三洋药业有限公司(批号：210801-2)，CAZ购自海南海灵化学制药有限公司(批号：2110211)，ATM购自山东罗欣药业有限公司(批号：321063008)，IPM购自杭州默沙东制药有限公司(批号：u025798)，LVX购自华夏生生药业有限公司(批号：210815307)，GEN购自瑞阳制药有限公司(批号：21052611)。

将6株PA送浙江天科高新技术发展有限公司做全基因组测序，提取管家基因acsA、aroE、guaA、mutL、nuoD、ppsA和trpE的序列放在PAMLST数据(https://pubmlst.org/organisms/pseudomonas-aeruginosa)中比对得到序列型(ST)。

使用肉汤活化黏液型PA，并调整浓度至0.5麦氏比浊度。

吸取30μL菌液加入到含200μL肉汤的聚苯乙烯96孔板中，常温条件下水平振荡仪上低频振荡，培养48h形成生物膜。

使用高压去离子水轻柔冲洗96孔板3次，去除浮游细菌后，倒扣，室温晾干。

在已构建的PA生物膜中，加入200μL含有抗菌药物的肉汤，抗菌药物的种类为TZP、CAZ、ATM、IPM、LVX和GEN中任意1种或2种，抗菌药物终浓度为菌株MIC的1/2。

同时设立阴性对照孔位，加入等量无药液肉汤。

37℃孵育48h后冲洗3次去除浮游细菌并晾干，采用结晶紫染色洗脱法定量检测残留生物膜:(1)加入200μL1%的结晶紫染色液，室温染色10min。

(2)冲涤后加入200μL乙醇：丙酮洗脱液(V∶V为70∶30)室温作用10min。

(3)使用酶标仪测定洗脱后孔位595nm的吸光度(A)并计算生物膜抑制指数[9]。

生物膜抑制指数=[(对照孔位A值-测试孔位A值)/对照孔位A值]×100%。

生物膜抑制效果的评价实验均平行做2次，生物膜抑制指数取均值。

对正态分布的计量资料两组间均值比较采用独立样本t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

6种抗菌药物TZP、CAZ、ATM、IPM、LVX和GEN对黏液型多重耐药PA的MIC。

测序后提取6株黏液型多重耐药PA的管家基因acsA、aroE、guaA、mutL、nuoD、ppsA和trpE的序列，放在PAMLST数据进行MLST数据比对，结果显示均为ST235型。

种抗菌药物对PA的MIC(μg/mL)

菌株编号	TZP	CAZ	ATM	IPM	LVX	GEN
PA29016	64	16	32	64	8	16
PA01005	64	16	16	64	16	32
PA09012	64	16	16	32	2	0.5
PA03019	2	4	4	8	0.5	0.5
PA06053	16	8	16	8	1	2
PA26017	64	16	64	128	16	16

在1/2MIC时，TZP、CAZ、ATM、IPM、LVX、GEN单独或联合对6株多重耐药PA的生物膜抑制指数。

6种抗菌药物中任意2种联用或单独使用分别作用于6株PA的生物膜，获得的生物膜抑制指数均符合正态分布(P>0.1)。

2种药物联用的15种组合当中，LVX+IPM和LVX+ATM的生物膜抑制指数大于70.0%，GEN+IPM、TZP+ATM、ATM+IPM和GEN+TZP的生物膜抑制指数大于60.0%，其余9种组合的生物膜抑制指数大于50.0%。

6种药物单独作用于生物膜，抑制指数均小于50.0%，均值从大到小依次为LVX、IPM、ATM、GEN、TZP和CAZ，其中LVX的抑制指数均值为42.3%。

对21组数据进行独立样本t检验，发现任意2种药物联合作用的15组数据中，LVX+IPM和LVX+ATM之间及LVX+ATM、GEN+IPM与其他药物联用组合相比，生物膜抑制指数差异均有统计学意义(P<0.05)。

6种药物单独作用于生物膜的抑制指数间差异无统计学意义(P>0.05)，但小于任意2种抗菌药物联用组合的生物膜抑制指数(P<0.05)。

常用抗菌药物单独或联合对6株PA的生物膜抑制指数(%)

抗菌药物	PA29016	PA01005	PA09012	PA03019	PA06053	PA26017	[MathProcessingError]	s
LVX+IPM	82.0	81.5	77.9	72.8	78.9	79.4	78.8①	3.3
LVX+ATM	74.5	74.6	75.8	70.1	73.1	74.9	73.8②	2.0
GEN+IPM	66.3	67.4	65.8	67.4	58.2	66.5	65.3③	3.5
TZP+ATM	59.3	61.3	68.0	49.2	64.3	74.4	62.8③	8.5
ATM+IPM	64.7	61.7	67.2	55.5	54.6	68.8	62.1③	6.0
GEN+TZP	56.6	58.1	65.8	68.8	53.0	63.6	61.0③	6.0
GEN+CAZ	57.7	61.1	54.5	52.5	63.2	52.0	56.8③	4.6
GEN+ATM	47.7	55.0	61.2	57.1	66.0	51.4	56.4③	6.6
LVX+GEN	62.4	55.3	52.7	58.1	55.1	51.2	55.8③	4.0
LVX+CAZ	63.9	51.4	51.4	64.3	57.6	45.7	55.7③	7.5
TZP+CAZ	57.6	44.8	52.5	58.1	51.9	67.9	55.5③	7.8
CAZ+IPM	60.6	47.9	68.9	55.9	49.6	48.7	55.3③	8.3
TZP+IPM	46.9	54.5	61.7	54.2	52.4	61.0	55.1③	5.6
LVX+TZP	53.5	54.1	52.0	54.5	53.4	44.8	52.1③	3.7
CAZ+ATM	47.3	52.6	53.9	54.3	50.2	46.8	50.9③	3.3
LVX	39.0	45.2	39.1	36.7	50.3	43.7	42.3	5.0
IPM	37.4	35.0	33.0	41.1	31.2	41.2	36.5	4.2
ATM	30.4	36.3	36.2	32.6	35.6	40.0	35.2	3.3
GEN	29.2	33.4	38.1	31.0	35.1	32.0	33.1	3.2
TZP	37.7	31.8	29.6	37.0	34.6	26.7	32.9	4.3
CAZ	29.0	30.8	31.1	32.1	26.9	36.6	31.1	3.3

黏液型PA由于细胞外存在大量藻酸盐成分，比非黏液型菌株更容易形成可见的生物膜结构，但生物膜却是致病菌在体内定植的普遍模式。

当生物膜相关菌株同时为多重耐药菌时，临床医生将很难选择合适的抗菌药物使用方案。

TZP、CAZ、ATM、IPM、LVX和GEN分别是青霉素类+酶抑制剂、头孢菌素类、单环β-内酰胺类、碳青霉烯类、氟喹诺酮类和氨基糖苷类的代表性抗菌药物，本研究通过比较在亚抑菌浓度下，这些药物对本院6株ST235型多重耐药PA菌株的生物膜体外联合抑制效果，发现LVX+IPM联用的抑制效果最好，其次为LVX+ATM。

说明在相同的耐药水平下，氟喹诺酮类与碳青霉烯类或单环β-内酰胺类抗菌药物联用对于PA生物膜具有更好的抑制效果。

由于不携带正电荷，具有良好的生物膜穿透性，氟喹诺酮类被认为是生物膜内作用效果最好的一类抗菌药物。

有文献报道，LVX+IPM对PA慢性肺部感染有很好的治疗效果。

由于亚抑菌浓度下长时间作用，很多抗菌药物包括氟喹诺酮类和IPM都可以诱导PA生物膜的形成及耐药性的加强，因此临床选择抗菌药物时，首先仍应根据药敏试验结果选择敏感的药物进行抗生物膜治疗。

既往的体外联合用药表明，β-内酰胺类、氟喹诺酮类和氨基糖苷类抗菌药物联合治疗PA感染时，通常表现为协同、相加或无关。

本研究当中，6种抗菌药物任意2种组合后，对生物膜的抑制效果均好于抗菌药物单独使用，因此临床上在治疗生物膜相关感染时应尽量选择联合用药。

本研究使用的6株黏液型多重耐药PA均分离自本院临床患者，经MLST数据对比，显示都归属ST235型，具有一定的同源性，这可能是导致本研究中的各组生物膜抑制指数均呈正态分布的主要原因。

由于不同地区PA菌株的耐药基因与表型不同，抗菌药物的体外抑制效果与体内也可能存在差异，因此抗菌药物联合应用对PA生物膜抑制效果的比对结论后续仍有必要进一步验证。