蝴蝶兰是兰科中种植规模最大，普及程度最广的兰科物种，我们在全基因组范围内鉴定了蝴蝶兰两大与花器官发育相关的基因家族——MADS和 AP2 家族，并通过系统发育、基因结构、共线性等分析，明确了这两大基因家族的基本属性、以及拟南芥 ABCE 模型中花器官属性基因在蝴蝶兰中的对应直系同源基因。
我们通过对 PaMADS 和 PaAP2 两大基因家族进行全基因组鉴定和分析，要明确这两个家族的系统发育，基因结构特点，各个亚家族所包含之启动子调控元件，这对于从这两个家族中进一步挖掘植物发育或者逆境胁迫响应基因，有重要的参考价值。
MADS基因家族基因对蝴蝶兰的影响
利用 TBtools 得到蝴蝶兰全基因组序列与拟南芥参考序列的 blast 比对结果后，使用 NCBI中的 CDD 程序别处不含 MADS-box 保守结构域，通过这两次筛选共得到 57 个蝴蝶兰 MADS-box 基因家族成员，表 11对蝴蝶兰 MADS-box 转录因子的基因编号、氨基酸数量、等电点、分子量进行了展示，并依次命名为PaMADSI~PaMADS57。通过对蝴蝶 MADS-box 基因编码蛋白的理化性质进行分析，发现他们在氨基酸数量、等电点、分子量方面存在显著差异。
从表中我们可得知，MADS-box 基因家族的成员，长度从 8aa 到 510 aa 不等。其中，小于 200aa 的有 17 个，占总数的 29.8%。介于 200 a 至400a 的有38 个，占总数的 66.7%。其余的两个为大于 400aa。分子量从 9556.1 到 55364.6不等。等电点在 4.4 和 10.87 之间，小于 7 的成员仅有 14 个，其余成员呈碱性。
II型 MADS-box 基因通常含有多个内含子。而I型 MADSbox 基因通常含有一个甚至没有内含子[113,114。PaMADS家族基因结构分析发现type II 类型的成员的 gDNA 长度在 20,000 bp 以上，其所含的内含子数量最多的达到 11 个，多数为78 个。而 typel型的成员 gDNA 长度相对较短在 20,000 bp以下，有 9个成员含有一个内含子，有 20 个成员只含有一个或没有内含子。
我们对植物、哺乳动物等一系列的研究表明，有无内含子对相同基因的表达有十分明显的差异。内含子介导的增强效就是用来表示一种基因含有内含子结构比不含内含子结构表达量高的情况，剪接体剪切内含子这一过程几乎可以影响到mRNA 表达调控的所有途径。type的MADS 家族成员多涉及植物花、果、种子的发育，更需要精细化的表达调控，因此，此类成员内含子普遍多一些。
利用 MEME 软件分析目标基因的氨基酸序列，共有 20 个 motif 被鉴定出来，结合 PaMADS 家族系统进化树发现，亲缘关系近的成员，其所含的 motif 也大多相似(图2.4)。type-I型 PAMADS 蛋白含 MADS-box 结构域和 K-box 结构域，而 type-I 型蛋白不含 K-box 结构域。motif1 和 motif5 是构成 MADS 结构域的重要部分，而 motif2，motif4，motif6 构成了 K-box 结构域。50 个成员均含有motif1，而剩余成员均含有 moti5:构成 K-box 结构域的 motif2，motif4，motif6也普遍存在于 PaMADS家族成员中，此外还有一些未知motif,如motif17、motil20motif15、motif10 等。
在进化过程中，MADS-box 蛋白保守性和多变性共存。值得注意的是，PaMADS20 和 PaMADS25 不存在 motifl 和 moti5，但经NCBI中 CCD-search 工具分析,确实有 MADS 结构域,进化树中也被分在SVP,Ma分支。由此可见，该基因的拼接上存在 gap，导致其 motif 分析出现不一致的地方，类似的问题也出现在 PAMADS51 和 PAMADS46 中。
AP2基因家族基因对蝴蝶兰的影响
利用MEME进行motif 预测，结果显示，单个基因家族成员拥有的 motif数量为 3-7，所有的 PaAP2 家族成员均具有 motifl，说明motifl 是 PaAP2 家族共有的结构域。R4V亚家族的成员 (PaAP2-01~10) 都具有 otif7，motit8，且这两个 motif 在其他亚家族中未见分布，说明这两个 motif 是 RAV 亚家族的特有序列，AP2 亚家族的特有 motif 是 motif2motif3。
对于 ERF 亚家族(PAAP2100~110)，motif5，moti6，motif14，motif20 是其特色结构域。除了这三个亚家族，其余三个亚家族尚未发现特征 motif， 也有很多不是亚家族层面共有，只在亚家族内某些成员共有,或者跨亚家族成员之间共有,这显示了该PAAP2家族成员保守性与变异性共存。
基因复制是指以母链为模版，从而使 DNA 片段复制出一个或多个拷贝，这种 DNA 片段可以是一小段基因序列抑或是一整条染色体，甚至是整个基因组。基因复制有两种模式:串联基因复制和大片段基因复制。
蝴蝶兰AP2基因家族的Circos图中连线部分表示: 蝶兰 121 个AP2 家族成员中有 25 个基因之间存在共线性关系。但也不能忽略的是，该版本的蝴蝶兰基因组组装存在缺陷，未能准确组装到染色体，因此蝴蝶兰种内的共线性有待进一步研究。
在蝴蝶兰与拟南芥的 4P2 基因中，共有 10 个基因存在共线性关系，仅有2个 Pa4P2基因与拟南芥 A1AP2 之间存在共线性关系，表明AP2基因家族扩张可能出现在蝴蝶兰和拟南芥的分化之前。在拟南芥和蝴蝶兰物种形成后，两个物种的基因成员各自演化，造成现在明显的微弱的染色体线性关系。
AP2 是一类庞大的转录因子，在植物的生长发育以及生物和非生物逆境响应中发挥重要作用，关于蝴蝶兰 AP2 基因家族的研究未见报道，我们从蝴蝶兰基因组中鉴定获得 121条 PAAP2 基因序列，其中RAV亚家族有28个成员，DREB 亚家族有 19 个成员，AP2 亚家族有 20 个成员，ERF 亚家族有25个成员。
它们至少含有一段 60 个左右氨基酸残基构成的 AP2 保守结构域，这和模式植物中 AP2 家族基因的结构特点相符合。AP2 亚家族成员具有 2个AP2保守结构域，ERF 亚家族成员具有1个AP2 保守结构域，RAV 亚家族成员具有1个AP2 保守结构域和 1个 B3 DNA 基序。
根据序列差异，ERF 亚家族可分为 DREB 组和 ERF 组。在拟南芥中，这两个组的区别在于 AP2 结构域第 14 位和第 19 位的氨基酸有变化，DREB 组在第14 和 19 位的氨基酸分别是 V 和 E，ERF 组在第 14 位和 19 位氨基酸分别是 A和 D。但在对其他植物的研究中,DREB 组的第 14 位氨基酸残基都为缴氨酸,但第 19 位氨基酸残基不都为谷氨酸 ，ERF组的第 14 位和第 19 位氨基酸残基也并不都是丙氨酸和天冬氨酸，且在该组成员中还存在第 14 位氨基酸残基是缀氨酸的现象。
所以该位点的保守性并不是绝对的，且其在不同物种中的保守性也有些微差异。在蝴蝶兰中，DREB 和 ERF 组成员的 AP2结构域的第 14 位氨基酸残基分别为氨酸(V) 和丙氨酸(A)，只有 5 个成员例外，其中 4个成员是丝氨酸(S)，1 个是甘氨酸(G)。但蝴蝶兰 DREB 和 ERF组在第 19 位氨基酸残基上保守性不高,该位点存在谷氨酸(E)、天冬氨酸(D)、组氨酸(H)、亮氨酸(L)、丙酸(A)、甲硫(M)、(Q) 和氨酸(V)残基，以及还有两个成员分别是蛋氨酸(M)和天冬酷胺(N)。
结语
通过双向 blast 和保守结构域验证，共鉴定出 57 个 PaMADS 成员，分为type-I 型(29 个) 和 ype-Il型 (28 个)。ypeI 型大部分成员含 1个或不含内含子，type-II 型大部分成员含 5-8 个内含子。
该家族基因启动子区含有诸多与非生物因素胁迫，以及光、植物激素和生长发育等顺式作用元件。PaMADS家族中仅有 3 对成员具有共线性，表明该基因家族并未产生较大扩张，这可能也是该基因家族成员数偏少的原因之一，与 ATMADS 家族的共线性关系也比较微弱，表明在拟南芥和蝴蝶兰物种形成后，前者的 MADSbox 基因经历了多轮重要的染色体重排和融合，而该基因家族在蝴蝶兰中则未经历大规模复制事件。这就造成现在微弱的染色体线性关系。
通过系统发育分析，鉴定出蝴蝶兰花器官属性基因30 个。PaAP1和 PaAP2在尊片、花瓣都保持较高水平的表达,而在唇瓣和合蕊柱中表达量则下降。PaAP3在花瓣和唇瓣中保持高水平表达，而在尊片和合蕊柱中表达量很低: PaPI 与PaAP3 不同之处是只在唇瓣中保持着最高水平的表达。PaAG 基因的表达量在合蕊柱中最高,PaSEP 在尊片和花瓣中高水平表达,在唇瓣和合蕊柱中表达量很低30个蝴蝶兰花器官属性基因的 CAI平均值小于 1,表明基因的密码子偏性较弱。
ARSCU法确定了9 个最优密码子，其中有编码 7 个密码子ARSCU>0.5，G/C结尾的有 5个，以 A/T (U) 结尾的有 2 个，说明蝴蝶兰花器官属性基因偏好以G/C 结尾的最优密码子，尤其偏爱以 C 结尾的密码子，与大多数单子叶植物使用偏好类似。奇偶偏好性、中性绘图及 ENC 绘图分析进一步说明蝴蝶兰花器官属性基因同时受到选择和碱基突变的影响其中，前者的分量更重一些。
