四维(4D)打印是增材制造中的一个新兴领域，这项技术有助于开发电子、生物医学、机器人和其他领域的高要求产品。目前，大多数报道的4D印刷系统是基于印刷对象的时间形状变换。除了形状之外，函数的时间异质性的诱导可以扩展4D印刷的范围。为此，来自上海交通大学的王瑾晔教授团队报道了一种4D打印方法，该方法使用了受淀粉样纤维形成机制启发的植物蛋白(玉米蛋白)凝胶（图1）。在这项研究中，玉米醇溶蛋白凝胶应用于添加制造，以生产具有可控特性的支架，同时研究了玉米醇溶蛋白溶液的凝胶化机理。相关研究成果以“Water-responsive 4D printing based on self-assembly of hydrophobic protein “Zein” for the control of degradation rate and drug release”为题于2022年11月25日发表在《Bioact. Mater.》上。
图1 基于疏水蛋白“玉米醇溶蛋白”的4D打印
- 玉米醇溶蛋白凝胶的制备及结构表征
玉米醇溶蛋白溶液的凝胶化机理受到淀粉样原纤维的启发，氢键驱动原纤维形成凝胶网络，作者使用冷冻-TEM、FTIR和ThT结合分析进行结构表征。玉米醇溶蛋白在水醇溶剂中溶解后形成球形自组装体(图2a)，而在玉米醇溶蛋白凝胶中，观察到最小直径为10 nm的纤维状网络(图2b)。FTIR分析显示在1625-1635 cm处有一个小肩−1表明胶凝过程中β-折叠的形成(图2c)。此外，从二阶导数光谱中观察到β-折叠含量的移动，表明新的β-带(图2d)。与玉米醇溶蛋白凝胶的阳性ThT结合表明玉米醇溶蛋白溶液的胶凝是淀粉样蛋白引起的(图2f–h)。
图2 玉米醇溶蛋白凝胶的制备及结构表征
- 玉米醇溶蛋白凝胶的流变特性和印刷适性
接下来，作者评估了凝胶的流变性质以建立可印刷性的理论估计。凝胶在较高剪切速率下表现出低粘度的剪切变稀行为(图3a)。应变/应力扫描曲线显示玉米醇溶蛋白凝胶具有粘弹性，在低应变下具有比粘性模量更高的弹性模量值(图3b)。对于所有的玉米醇溶蛋白凝胶，在经过100%应变后也观察到了结构恢复能力，这使得印刷结构的稳定性(图3c)。总的来说，玉米醇溶蛋白凝胶表现出适于直接打印的流变性质。此外，由于玉米醇溶蛋白凝胶由氢键驱动，因此挤出后可以自组装，导致连续的丝状凝胶挤出(图3d-e)。同时，屈服应力和结构恢复进一步支持细丝在重力作用下不塌陷(图3f)。
图3 玉米醇溶蛋白凝胶的可印刷性评估
- 支持浴中玉米醇溶蛋白凝胶的4D印刷
在玉米醇溶蛋白凝胶中淀粉样蛋白原纤维之间存在氢键，并且在水浸泡时，疏水相互作用占优势，导致凝胶固化。因此，作者对其进行了概念认证，12小时内未观察到CB60的尺寸变化，这可能是由于玉米醇溶蛋白凝胶和支持浴之间平衡的氢和疏水相互作用。
图4 在不同水浓度的Carbopol浴(CB75和CB40)中印刷玉米蛋白期间结构变化的机理
对于整体结构转变，作者提出了一种机制，以双层Carbopol支持浴(CB75/CB40)中负载染料的蝶形结构为例（图4）。在CB75中，玉米醇溶蛋白倾向于快速自组装，疏水吸引占优势，导致结构/细丝的收缩。在CB40中，由于水浓度低，玉米醇溶蛋白分子和支持介质的溶剂之间的氢键占优势，导致结构/细丝增加，形成松散的网络。如下视频进一步验证了这一点，同时也说明了支持浴玉米醇溶蛋白凝胶的4D印刷。
- 打印构建体的降解速率
通过计算在含有蛋白酶XIV的降解介质中的重量损失百分比来评估干燥后的印刷构建体(导管状)的降解速率。随着支持浴中水浓度从75%降至40%,降解速率显著降低。在CB75中印刷的导管在10天内降解了88.2±1.17%，剩余结构的完整性丧失(塌陷)，降解过程中导管的壁厚也减少(图5a-b)。印刷在CB75中的导管比印刷在CB40中的导管具有更高的孔隙率(图5c)。较高的孔隙率促进了介质的渗透，从而导致更快的降解，而孔隙率较低的导管(CB40)限制了水的渗透。
此外，作者还评估了CB75-CB40-CB75三段导管作为大鼠坐骨神经损伤模型中的神经导管(15 mm)的降解速率(图5e)。CB75-CB40-CB75导管显示出较快的末端降解，这是由于存在高多孔CB75部分，而中间部分降解缓慢(CB40) (图5f)。导管的近端部分比远端部分降解更快，这是因为近端部分的神经再生更快。相反，在CB40-CB75-CB40导管中，中间部分(CB75)比末端位置(CB40)降解更快(图5g)。与之对应的HE染色进一步证明了这一点。
图5 评估导管的降解速率
- 结构异质性应用的概念证明
为了提供结构异质性应用的概念证明，在双层支持浴(CB75/CB40)中印刷装载盐酸环丙沙星(CPFX)的导管和装载阿霉素(DOX)的蝶形构建体。CPFX是一种常用的抗生素，DOX被用作抗肿瘤剂。打印在CB75中的导管的CPFX负载和药物释放速率高于印刷在CB40中的导管(图6a-b)。与CPFX一样，观察到在CB75中印刷的结构的DOX加载和释放高于在CB40中印刷的速率(图6d-e)。将该结构分成两部分以评估装载DOX的蝴蝶的细胞毒性，在CB75中印刷的蝴蝶内发现了对BEL7402细胞有更高的细胞毒性(图6f)。总之，双相控释可能有助于实现初始快速释放和长期持续释放。依赖于支持浴的水浓度的不同药物释放可以用孔隙率来解释。CB75中印刷的构建体的更高孔隙率通过溶解介质的容易渗透而导致更快的释放。
图6 结构异质性应用的证明
- 导管作为输尿管支架在猪模型中的功效
最后，作者在猪模型中，将4D打印玉米蛋白导管用为药物洗脱、可生物降解的输尿管支架。在动物实验中，作者设计了实验来评估印刷在CB75或CB40中的载有CPFX的导管的尿液排泄和抗菌功效，以验证差异药物释放(图7a)。手术前，静脉注射碘海醇3 min后，观察到肾盂、肾盏和输尿管，表明分泌和排泄功能正常。肾盂和输尿管中的造影剂在注射后30分钟消失(图7b)。术后4天，注射后3分钟出现肾盂和输尿管，肾盂和输尿管没有扩张，表明分泌和排泄良好。造影剂穿过支架植入部位。注射后60分钟，肾盂和输尿管中的造影剂消失(图7b)。此外，CFUs计数测试显示，在CB75中印刷的支架比在CB40中印刷的支架具有显著更高的CFUs(图7c)。总的来说，玉米蛋白支架显示动物模型中尿液引流功效和抗菌活性，可用于制备4D打印药物洗脱可生物降解输尿管支架。
图7 猪模型中打印导管作为输尿管支架的应用
综上，本文将玉米醇溶蛋白凝胶应用于添加制造，以生产具有可控特性的支架。作者发现氢键结合的淀粉样原纤维是剪切应力下玉米醇溶蛋白凝胶形成的原因。玉米醇溶蛋白凝胶具有水诱导的自组装特性，该特性被开发用于使用特制支持浴的4D印刷。疏水吸引在不同水浓度的支持浴中引起不同的自组装。疏水性自组装的显示出可控的印刷结构性质，特别是对于生物医学目的，并且提供了可调的药物负载、药物释放和降解速率。动物研究进一步验证了这种4D打印结构的显著翻译潜力，同时这个原理可以进一步扩展到其他材料的4D印刷。
文章来源：https://doi.org/10.1016/j.bioactmat.2022.11.009
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