镉（Cd）污染对作物生长发育、食品安全和人类健康造成严重威胁，并成为潜在的农业和全球环境问题。锌（Zn）被用于减少土壤和植物中Cd的积累。位于质膜（PM）上的蛋白质在植物逆境信号传递中起着重要作用。随着植物对重金属的吸收、运输和耐受机制研究的深入，胁迫相关PM蛋白的研究意义日益凸显。
2022年5月，来自中国水稻研究所的林晓燕团队在Journal of Hazardous Materials （IF=14.224）上发表题为“The potential role of plasma membrane proteins in response to Zn stress in rice roots based on iTRAQ and PRM under low Cd condition”的研究文章。该研究利用蛋白质组学和PRM靶向组学技术分析了低镉条件下水稻根系质膜蛋白对锌胁迫响应的差异变化，以及差异表达蛋白参与锌-镉转运的响应机制，为进一步研究水稻耐重金属胁迫、生长发育和代谢调控的分子机制提供了基础数据参考。中科新生命为其提供了iTRAQ蛋白质组学和PRM靶向定量蛋白组学技术服务。
研究材料：
实验组（T）和对照组（CK）处理7天后的水稻根部PM蛋白，每组三个生物学重复。
技术路线：
步骤1: 锌对低镉处理水稻幼苗锌和镉积累的影响；
步骤2: 锌胁迫下的定量蛋白质组学检测；
步骤3: 差异表达蛋白的生信分析；
步骤4: 锌-镉转运相关蛋白的研究；
步骤5: 候选蛋白的PRM验证。
研究结果：
1、锌对低镉处理水稻幼苗锌和镉积累的影响
低浓度的Zn促进了水稻幼苗中Cd的吸收和积累，导致Cd含量增加，抑制了水稻幼苗的生长（协同效应）;中等浓度的Zn抑制了Cd的吸收和积累，促进了幼苗的生长（拮抗作用）。但是，如果Zn浓度过高，虽然Zn可以抑制水稻中Cd的吸收和积累，但不利于水稻幼苗的生长，甚至对水稻幼苗产生较高的Zn毒性（拮抗作用）。
2、锌胁迫下的定量蛋白质组学检测
通过iTRAQ蛋白质组学技术对PM蛋白进行定量检测，并通过生物信息学分析经过CK和T4处理7天后的水稻根系。从CK水稻根中提取的PM蛋白样品中共鉴定出14,326个肽段和4,008个蛋白质，其中192个上调，140个下调。
图1蛋白质组学鉴定数量和火山图
3、差异表达蛋白的生信分析
通过层次聚类分析可以看出对照组和处理组的每三个重复分别聚集在一起，具有很高的重复性。同时，两组水稻根系蛋白质表达丰度和表达水平存在显著差异。
图2 差异表达蛋白层次聚类分析
对差异表达蛋白（DEPs）的生物学过程（BP）、分子功能（MF）和细胞组分（CC）进行GO注释和功能富集度分析，发现PM蛋白对重金属胁迫非常敏感，在响应重金属胁迫和减轻重金属的毒性作用方面起着重要作用。
图3 差异表达蛋白GO注释和富集分析
KEGG通路分析发现与植物代谢相关的DEPs主要参与谷胱甘肽代谢、苯丙酸生物合成、光合生物固碳等。谷胱甘肽常被用作植物各种代谢过程中的氧化还原活性剂和解毒化合物，也是运输和生物合成的中间产物。在本研究中，高浓度锌对水稻有较强的刺激作用，导致谷胱甘肽活性和含量增加，以抵抗锌处理的毒性效应。富集分析发现，在重金属处理下，铂类耐药性、α-亚麻酸代谢、内分泌和其他因素对钙重吸收的调节、囊泡运输中的圈套相互作用、类黄酮生物合成、ABC转运蛋白和赖氨酸降解均受到显著影响。
图4 差异表达蛋白KEGG通路注释和富集分析
4、锌-镉转运相关蛋白的研究
在GO分析和KEGG通路分析中记录了参与Zn2 +和Cd2 +转运的7个DEPs。其中，3个DEPs上调（A2XQ09、B8B248和B8AAT90）；4个DEPs下调（B8AB68、A0A1B1ELU7、A2XPS1和B8BN76）。PPI互作分析显示，这7个DEPs中有5个彼此相互作用。
图 5 差异表达蛋白的PPI互作网络
5、候选蛋白的PRM验证
建立4种候选蛋白质（B8AB68，B8AAT9，A0A1B1ELU7和B8BN76）的PRM检测方法进行靶向验证。结果表明，蛋白A0A1B1ELU7在不同处理中具有相同的表达变化。
图6 候选蛋白的PRM定量结果
小结
综上所述，本文利用相对定量蛋白质组学和PRM靶向验证在蛋白质水平揭示了胁迫响应中Zn/Cd相互作用和跨膜转运机制，并找到了与水稻根系重金属摄取和转运相关的潜在靶蛋白。本研究为水稻根系重金属胁迫反应蛋白生物标志物的筛选及抗重金属胁迫的解毒机理提供了基础数据参考。
