2012年6月28日，《Science》杂志在线发表了一篇论文：A Programmable Dual-RNA–Guided DNA Endonuclease in Adaptive Bacterial Immunity，[1]宣布了这一在生命科学领域和医学领域掀起基因编辑革命浪潮的CRISPR-Cas基因编辑技术横空出世。（图1）
此后的10年里，CRISPR-Cas基因编辑技术被全世界科学家不断地开发改良，并将其应用于疾病治疗、作物育种、功能基因组研究等多个领域。而该技术的两位先驱JENNIFER A. DOUDNA和EMMANUELLE CHARPENTIER也于2020年获得了诺贝尔化学奖，以表彰她们在CRISPR-Cas基因编辑技术发现和研发上的卓越贡献。
图1：Science报道CRISPR基因编辑技术
今年是CRISPR-Cas基因编辑技术问世的第10年，那么这项技术到底给科学界和人类带来了哪些改变和应用呢？使用Web of Science工具检索CRISPR相关文献，我们发现在2012年以前只有零星关于细菌CRISPR序列的研究报道。
2012年以后，对CRISPR-Cas基因编辑技术的研究则是以井喷式的速度被各大期刊报道出来。这其中，加州大学系统、哈佛大学以及中国科学院名列对CRISPR基因编辑技术研究产出最大的研究机构前三甲。（图2）
图2：Web of Science检索CRISPR文献结果可视图
CRISPR-Cas基因编辑技术
随着生命科学研究尤其是基因测序技术的不断发展，基因编辑技术也逐渐成为了基础科学研究的有力工具。其中CRISPR-Cas9基因编辑技术的开发凭借其成本低廉、操作方便、效率高等优点，已逐渐成为继锌指核酸内切酶(ZFN)、类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN) 之后的第三代基因组编辑技术，被广泛地应用于基因编辑领域。
CRISPR-Cas系统最早在细菌和古细菌中被发现，是细菌长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御机制，用来对抗入侵的病毒及外源DNA。该系统其实早在2003年就被西班牙微生物学家Francisco Mojica发现。他提出在细菌和古菌当中广泛存在一种免疫机制，可在当时这一发现并没有吸引人们的注意力。于是，这项研究经历了漫长痛苦的拒稿后（从Nature、PNAS一直到NAR都被残忍拒稿），最终发表在《分子演化杂志》。而CRISPR （Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）也由此首次进入人们的视野。
图3：CRISPR-Cas研究时间线[2]
2013年2月15日，张锋等人将CRISPR-Cas9技术成功应用于哺乳动物和人类细胞的基因编辑。此后，也发生了张锋与DOUDNA和CHARPENTIER等人著名的专利权之争。最终结果在法律上张锋获得了CRISPR-Cas9技术的专利权。但三人在该技术上的贡献也都有目共睹，因此也被人成为“CRISPR三巨头”。
图4：CRISPR三巨头
而随着全世界科学家们的前赴后继研究，接连开发出了CRISPR-Cas9、CRISPR-Cas3、CRISPR-Cas12a等工具，也衍生出来刘如谦等人开发的先导编辑Prime Editor等。其中以CRISPR-Cas9技术为代表的基因编辑技术逐渐发展出了各种功能，例如：DNA剪切、转录激活（CRISPRa）、转录抑制（CRISPRi）、DNA甲基化和去甲基化、组蛋白修饰、DNA碱基转编辑等等。正如图5所示，CRISPR-Cas9的多功能性就像一把分子生物学研究的“瑞士军刀”促进了各项基础科学研究。
图5：CRISPR-Cas9多功能性图示[3]
CRISPR基因编辑治疗人类疾病
《Nature》杂志曾评论说：“CRISPR基因编辑技术自问世以来，就一直被吹捧为治疗疾病的游戏规则改变者。”但要使这个梦想成为现实，最关键的就是如何将CRISPR-cas9工具成功导入人体，并保证其安全有效地编辑目标基因？
2021年6月，《NEJM》刊登的一篇文章：CRISPR-Cas9 In Vivo Gene Editing for Transthyretin Amyloidosis，[4]该研究进行人体内基因编辑临床试验，使用脂质纳米颗粒（LNP）递送CRISPR-Cas9并靶向肝细胞，使其特异性沉默TTR基因，从而治疗转甲状腺素淀粉样变性病。（图6）研究结果显示，所有的参与者畸形蛋白质水平都下降，其中两个接受了高剂量的蛋白质水平平均下降了87%。
图6：CRISPR-Cas9治疗转甲状腺素淀粉样变性病
值得注意的是，这是首个体内 CRISPR 基因编辑疗法的临床试验结果，大大扩展了 CRISPR 基因编辑疗法的应用范围，为许多遗传疾病的治疗开辟了新的途径。
除此之外，使用CRISPR-Cas9技术治疗艾滋病也成了众多科研人员关注的研究方向。2019年，邓宏魁研究组、陈虎研究组以及吴昊研究组合作在《NEJM》也报道了使用CRISPR-Cas9技术基因编辑修饰人成体造血干细胞中CCR5基因，重建人体的造血系统。[5]
图7：《NEJM》报道使用CRISPR-Cas9技术治疗艾滋病和急性淋巴细胞白血病患者
该研究系全球首例利用CRISPR/Cas9基因编辑技术编辑造血干细胞并移植到艾滋病和急性淋巴细胞白血病患者体内进行治疗，初步证明了基因编辑造血干细胞在临床应用中的可行性与安全性。
CRISPR技术在新发、突发传染病领域的应用
随着CRISPR基因编辑技术的不断开发，在传染病防治方面也展现了其卓越的性能。2019年10月，MIT和哈佛大学Broad研究所的Pardis C. Sabeti、张锋等人在《Molecular Cell 》发表了一篇：Programmable Inhibition and Detection of RNA Viruses Using Cas13 的研究论文。[6]
该研究将Cas13的抗病毒活性用于RNA病毒检测，建立了一个强大和快速可编程的诊断和抗病毒系统，命名为CARVER。之后，为应对突如其来的新冠肺炎疫情，张锋实验室开发的核酸检测系统SHERLOCK实现了在1小时内检测SARS-CoV-2。
图8：将Cas13的抗病毒活性用于RNA病毒检测
在艾滋病治疗上，2022年6月发表在《Nature Biotechnology》上的一项研究，首次使用了CRISPR-Cas9技术针对小鼠体内的B细胞进行基因编辑，使其分泌靶向HIV病毒的广谱中和抗体，从而达到治疗艾滋病的目的。[7]
图9：使用CRISPR-Cas9技术对B细胞基因编辑
该研究使用了两个腺相关病毒载体（AAV）在体内工程化B细胞，其中一个编码金黄色葡萄球菌Cas9（saCas9），另一个编码一种抗HIV病毒的广谱中和抗体3BNC117。当CRISPR导入B细胞后，便会引入该抗体基因。
小鼠实验证明，B细胞可以在体内安全可靠地进行基因编辑。免疫接种后，基因编辑后的B细胞同样经历了抗原诱导的激活，并形成免疫记忆、克隆选择以及分化为可分泌广谱中和抗体的浆细胞。
CRISPR技术在农业和作物育种中的应用
在农业和作物育种领域，使用CRISPR-Cas技术提高作物产量、品质、抗病性和除草剂抗性、育种和加速驯化等方面依然有着广泛且重要的应用。随着测序技术的快速发展，越来越多植物物种的基因组信息变得可用，CRISPR-Cas基因编辑系统不仅帮助开发具有理想性状的新品种，而且还彻底改变了当前的育种系统。[8]
与传统育种方法不同，CRISPR Cas技术通过精确的基因组编辑，删除导致不需要性状的负面遗传元素或引入功能获得突变，提供了一种快速生成理想种质的方法。
例如：在众多影响产量的因素中，调控细胞分裂素的动态平衡是提高谷物产量的可行途径。编辑水稻细胞分裂素激活酶LOGL5的C端，可提高水稻在多种环境条件下的产量；
敲除编码细胞分裂素氧化酶/脱氢酶(CKX)的基因，在小麦中产生高产表型；
通过敲除编码氨基酸渗透酶3的基因，培育出了在保持稻米品质的同时提高分蘖数和产量的水稻品种。
CRISPR-Cas介导的其他基因编辑，包括O. sativa PIN5b(调节穗大小)、O. sativa GS3(调节粒大小)和Triticum aestivum GW2、O. sativa GW2和O. sativa GW5(调节粒重)，也使作物产量得到了增加。除谷物外，研究人员还通过基因编辑控制分生组织大小的CLV40和ENO41提高了水果作物的产量。
在抗病性研究上，与引入显性抗性基因促进病原菌抗性的交互进化相比，利用CRISPR-Cas干扰寄主易感因子是保护植物免受生物胁迫的一种更有前景的方法。全球水稻生产受到细菌性疫病的严重威胁，这是一种由水稻黄单胞菌引起的毁灭性疾病。在感染过程中，一组细菌因子可以激活SWEET基因的转录，其产物是疾病易感性所需要的。利用CRISPR-Cas对O. sativa SWEET11、O. sativa SWEET13和O. sativa SWEET14启动子区域进行突变，获得了对X. oryzae pv具有广谱抗性的水稻系。同样，针对柑橘LOB1的启动子区域，也同样对柑橘黄单胞菌产生了抗性。
结语
尽管CRISPR-Cas基因编辑系统已经广泛应用于生命科学和医学领域的诸多方面，但是其存在的潜在局限，例如脱靶性也必须得到科研人员的重视。
此外，种系基因组编辑已经在动物和植物中得到广泛使用，并且已经用于人类胚胎的研究目的。但是当应用于人类可遗传基因组编辑时，正如国际科学组织所强调的那样，贺建奎等使用人类胚胎编辑导致双胞胎女婴出生的报告也使得基因组编辑在人体应用上必须严格监管。
综上所述，CRISPR-Cas技术的问世无疑促进了生命科学和医学研究的发展，相信在接下来的时间里，更多的功能和应用将会被科研人员发掘。
参考文献
[1] Jinek, M., et al. (2012). "A Programmable Dual-RNA-Guided DNA Endonuclease in Adaptive Bacterial Immunity." Science 337(6096): 816-821.
[2] 董乐,杨谐星,佟广香,闫婷,孙志鹏,徐欢,刘天奇,匡友谊.CRISPR/Cas9基因编辑原理、发展及应用[J].水产学杂志,2022,35(03):108-119.
[3] Doench, J. G. (2018). "Am I ready for CRISPR? A user's guide to genetic screens." Nature Reviews Genetics 19(2): 67-80.
[4] Rim, J. H., et al. (2021). "CRISPR-Cas9 In Vivo Gene Editing for Transthyretin Amyloidosis." New England Journal of Medicine 385(18): 1722-1722.
[5] Xu, L., et al. (2019). "CRISPR-Edited Stem Cells in a Patient with HIV and Acute Lymphocytic Leukemia." New England Journal of Medicine 381(13): 1240-1247.
[6] Freije, C. A., et al. (2019). "Programmable Inhibition and Detection of RNA Viruses Using Cas13." Molecular Cell 76(5): 826-+.
[7] Nahmad, A. D., et al. (2022). "In vivo engineered B cells secrete high titers of broadly neutralizing anti-HIV antibodies in mice." Nature Biotechnology.
[8] Zhu, H. C., et al. (2020). "Applications of CRISPR-Cas in agriculture and plant biotechnology (vol 21, pg 661, 2020)." Nature Reviews Molecular Cell Biology 21(12): 782-782.
