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阴道炎是一种常见的阴道微生物群紊乱失调症，霉菌性和细菌性阴道炎是两类常见阴道炎。
临床常用治疗阴道炎的广谱抗真菌药如甲硝唑、克林霉素对全身治疗和局部治疗有一定效果，但也有复发性和耐药性等问题。
与传统抗真菌药物相比，中药具有多靶点、整体调节的作用。
近年来，研究人员发现多种有抑菌活性的中药单体(如黄芩苷、小檗碱、苦参碱、蛇床子素等和中药外用制剂(如妇阴康洗剂、红核妇洁洗液、洁尔阴洗液等)。
妇阴康洗剂主要成分为秦皮、鱼腥草、苦参、仙鹤草、大青叶和紫花地丁，其主要功能为清热燥湿、除痒止带。
本研究通过测定妇阴康洗剂体外抑菌抗炎活性，及其对霉菌性阴道炎和细菌性阴道炎的治疗作用，为临床妇阴康洗剂的指导用药提供依据。
材料
药物
妇阴康洗剂浓缩液(批号200304,宿州亿帆药业有限公司),无菌纯水或适宜的培养基按1∶4稀释，即得，为临床使用浓度。
阳性对照药物：醋酸氯己定(批号D1201A,大连美仑生物技术有限公司);硝酸咪康唑、甲硝唑[批号B603BA0014、E515BA0003,生工生物工程(上海)股份有限公司]。
菌株
临床株：需氧菌金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、表皮葡萄球菌各5株，由东南大学附属医院检验科分离鉴定提供；厌氧菌加德纳菌5株、克氏动弯杆菌1株、二路普雷沃菌1株、卷曲乳杆菌3株由南京军区总医院检验科分离鉴定提供。
标准株：金黄色葡萄球菌(ATCC 25923)、大肠埃希菌(ATCC 25922)、铜绿假单胞菌(ATCC 27853)、白色念珠菌(ATCC 10231)、二路普雷沃菌(ATCC 29303)、克氏动弯杆菌(ATCC 35241)、卷曲乳杆菌(ATCC 33197)、詹氏乳杆菌(ATCC 25258)、惰性乳杆菌(ATCC 55195)、加德纳菌(ATCC 14018),为中国药科大学微生物教研室保存。
细胞
小鼠单核巨噬细胞RAW 264.7细胞株，为中国药科大学微生物教研室保存。
培养基
细菌培养基：MRS培养基(批号20190730)购自青岛高科技工业园海博生物技术有限公司；营养琼脂培养基(批号200418)、MH液体培养基(批号181116)、沙氏葡萄糖琼脂培养基(批号190923)、脑-心浸萃琼脂培养基(批号181105)、哥伦比亚血琼脂基础培养基(批号190117)购自北京三药科技有限公司。
细胞培养基：DMEM培养基(批号8120334)、胎牛血清(批号1872295)购自美国Gibco公司。
试剂
IL-1β、TNF-α ELISA试剂盒(批号A201B00913、A28201031)购自杭州联科生物技术股份有限公司。
氯化钠、碳酸氢钠等其他试剂均为国产分析纯。
动物
健康清洁级SD大鼠80只，雌性，成熟未交配，体质量(200±20)g, 购自上海杰思仪器
台式低速离心机(型号SC-04),安徽中科中佳科学仪器有限公司；立式压力蒸汽灭菌器(型号MLS-3781L),日本松下公司；培养箱(型号GNP-9160),上海精宏实验设备有限公司。
最低抑菌浓度(MIC)测定
参照CLSI标准，采用平板稀释法进行实验。
无菌水倍比稀释药物后制成含药平板。
多点接种仪蘸取相应菌悬液接种于含药平板中(每点接种量约为1×103 CFU),并设置阳性对照和空白对照。
适宜条件下培养后，无菌生长的最低药物浓度为其MIC值。
杀菌曲线测定
处于对数生长期的菌悬液与含相应液体培养基的药液混合，使菌液终密度为1×105 CFU/mL,药物终浓度为4×MIC,37 ℃培养，不同时间下吸取培养物进行梯度稀释和菌落计数，并设置阳性对照和空白对照。
适宜条件下培养后，记录菌落数并绘制杀菌曲线。
妇阴康洗剂对霉菌性/细菌性阴道炎模型大鼠的药效学研究
无菌较硬的棉拭子蘸取5×106/mL白色念珠菌或1×109 CFU/mL阴道加德纳菌临床株菌液反复涂擦雌性大鼠阴道内壁，然后注入菌液，剂量为100 μL/200 g。
每天接种1次，共7次。
首次接种后第9天，取大鼠阴道分泌物进行镜检、细菌培养。
感染成功的大鼠随机分为模型组、妇阴康洗剂组、硝酸咪康唑(0.02 g/kg)组或甲硝唑(0.05 g/kg)组，未感染大鼠作为空白对照组，每组5只。
将妇阴康洗剂浓缩液以无菌纯水按1∶1、1∶2、1∶4稀释得妇阴康洗剂高、中、低(4.4、2.2、1.1 mL/kg)剂量并注入大鼠阴道，每只500 μL;模型组和空白对照组大鼠以等体积无菌纯水进行冲洗，每天阴道给药1次，共7 d。
停药后第2天，收集大鼠阴道分泌物，稀释并接种至含5%肝素钠抗凝兔血的哥伦比亚培养基或选择性培养乳杆菌属的MRS培养基，37 ℃厌氧培养2～3 d以计数分泌物中加德纳菌和总乳杆菌的数量。
同时取大鼠阴道组织，HE染色观察病理变化。
妇阴康洗剂对白色念珠菌/加德纳菌感染RAW 264.7细胞炎症相关因子的影响
复苏RAW 264.7细胞，加入含10% FBS的DMEM培养基，于37 ℃、5% CO2环境下培养。
取对数生长期的RAW264.7 细胞，以每孔4×105个细胞的密度接种于24孔板中，24 h后以加德纳菌和白色念珠菌感染细胞(MOI=20),同时加入妇阴康洗剂、甲硝唑(200 μg/mL)、硝酸咪康唑(25 μg/mL),或等体积无菌生理盐水为模型组，每组3个复孔，同时设置未感染细胞组为阴性对照组。
感染8 h后，收集细胞上清，ELISA法检测细胞上清液IL-1β、TNF-α水平。
统计学分析
通过SPSS 22.0软件进行处理，计量资料以[Math Processing Error]表示，两组间比较采用独立样本t检验。
P< 0.05表示差异具有统计学意义。
妇阴康洗剂对细菌和真菌的MIC值
妇阴康洗剂对金黄色葡萄球菌的MIC稀释度范围为1/20～1/5,对表皮葡萄球菌、大肠埃希菌的MIC稀释度范围为1/20～1/10,对铜绿假单胞菌的MIC稀释度范围为1/10～1/5。
此外对甲硝唑或咪康唑不敏感的厌氧菌、真菌，妇阴康洗剂也有一定抑制作用，MIC约为其使用剂量的2.5倍稀释。
以上结果表明，妇阴康洗剂对细菌(需氧菌和厌氧菌)、真菌均有不同程度的抑制作用，对需氧菌的效果较好。
妇阴康洗剂对细菌、真菌的MIC值
试验菌(株数) | MIC范围/(μg·mL-1) | ||||
妇阴康洗剂(稀释度)* | 醋酸氯己定 | 甲硝唑 | 咪康唑 | ||
细菌(需氧菌) | 金黄色葡萄球菌(6) | 1/20～1/5 | 4 | — | — |
表皮葡萄球菌(6) | 1/20～1/10 | 16 | — | — | |
大肠埃希菌(6) | 1/20～1/10 | 2～4 | — | — | |
铜绿假单胞菌(6) | 1/10～1/5 | 16 | — | — | |
细菌(厌氧菌) | 加德纳菌(6) | >2/5 | — | >200 | — |
克氏动弯杆菌(2) | 2/5 | — | >200 | — | |
二路普雷沃菌(2) | 2/5 | — | >200 | — | |
乳杆菌(6) | 1/5 | — | >200 | — | |
真菌 | 白色念珠菌(6) | 2/5 | — | — | 25 |
注：*MIC稀释度指妇阴康洗剂临床使用剂量的稀释度。
妇阴康洗剂对细菌和真菌的杀菌曲线
2/5稀释度的妇阴康洗剂对细菌和真菌有杀伤作用。
其能在24 h内，使金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、加德纳菌、乳杆菌下降约1 lg(CFU/mL),使表皮葡萄球菌下降约2 lg(CFU/mL),使白色念珠菌下降约3 lg(CFU/mL)。
以上结果表明，妇阴康洗剂能在较长时间内维持稳定、温和的杀菌作用，但杀菌速度较慢。
妇阴康洗剂对加德纳菌感染引起大鼠阴道炎的抑菌抗炎作用
与模型组比较，妇阴康洗剂各剂量组大鼠阴道内加德纳菌载菌量降低约0.7 lg(CFU/mL)(P<0.05),而不抑制乳杆菌数量(P>0.05)。
此外，图3C显示，妇阴康洗剂组大鼠阴道病变程度较模型组减轻。
以上结果表明，妇阴康洗剂可抑制加德纳菌生长，但对阴道菌群优势菌乳杆菌没有明显抑制作用，同时可减少充血、水肿、出血、炎性浸润等症状，发挥抗炎作用。
妇阴康洗剂对白色念珠菌感染引起大鼠阴道炎的抑菌抗炎作用
与模型组比较，妇阴康洗剂各剂量组大鼠阴道内白色念珠菌的载菌量降低约2 lg(CFU/mL)(P<0.01),而不抑制乳杆菌数量(P>0.05)。
妇阴康洗剂组大鼠组织充血、中性粒细胞和单核巨噬细胞浸润等症状减轻。
以上结果表明，妇阴康洗剂可抑制白色念珠菌生长，但不抑制阴道菌群优势菌乳杆菌，并发挥抗炎作用。
妇阴康洗剂对加德纳菌诱导RAW 264.7细胞炎症因子分泌的抑制作用
与模型组比较，妇阴康洗剂组加德纳菌感染诱导的细胞IL-1β和TNF-α分泌减少(P<0.05,P<0.01)。
妇阴康洗剂可改善细胞形态，减轻细胞损伤，表现出良好的保护作用。
以上结果表明，妇阴康洗剂能减轻加德纳菌感染所致的细胞炎症反应，并对RAW 264.7细胞形态有明显改善作用。
妇阴康洗剂对白色念珠菌诱导RAW 264.7细胞炎症因子分泌的抑制作用
与模型组比较，妇阴康洗剂组白色念珠菌感染诱导的细胞促炎因子IL-1β和TNF-α分泌减少(P<0.01)。
妇阴康洗剂具有良好的形态保护作用。
以上结果表明，妇阴康洗剂能减轻由白色念珠菌感染所致的细胞炎症反应，并对RAW 264.7细胞形态有明显改善作用。
阴道炎是临床最常见的妇科疾病之一，病原体入侵导致阴道黏膜或黏膜下结缔组织发生炎症，常见的临床阴道炎症包括霉菌性阴道炎、细菌性阴道炎、滴虫性阴道炎等。
近年来，许多天然中草药单体成分都被证实具有抑菌活性。
姜科植物如高良姜、莪术和姜黄等醇提物已被证实具有抗真菌活性，其中也包括耐药真菌。
丁香酚可与真菌细胞膜结合，改变其结构或通透性，从而破坏酵母的细胞质膜，使得细胞内成分的释放。
穿心莲内酯磺酸钠盐具有显著的体内抗金黄色葡萄球菌感染活性、抗炎活性及免疫调节能力。
此外，临床上也有多种用于阴道炎治疗的中药复方外用制剂，如本研究所用的妇阴康洗剂。
妇阴康洗剂是可用于细菌性阴道病、滴虫性阴道炎、念珠菌阴道炎等阴道炎治疗的外用洗液。
本研究发现，妇阴康洗剂在体外对多种需氧菌、厌氧菌、真菌都具有良好的抑菌活性，并能在较长时间内维持稳定、温和的杀菌作用，其对白色念珠菌的MIC为其使用剂量的2.5倍稀释，对白色念珠菌的体外抑菌效果优于加德纳菌。
在白色念珠菌、加德纳菌诱导的RAW 264.7细胞感染模型中，妇阴康洗剂可抑制细胞炎症因子IL-1β、TNF-α分泌，并可减少细胞伪足伸长，减少细胞损伤。
在大鼠阴道局部感染模型中，妇阴康洗剂对大鼠阴道组织处的白色念珠菌的杀菌效果明显优于加德纳菌，并发挥抗炎作用，这与体外实验结果相一致。
此外，妇阴康洗剂对阴道菌群优势菌乳杆菌没有明显的抑制作用。
综上所述，妇阴康洗剂具有良好的体内外抑制白色念珠菌、加德纳菌的作用，表现出明显的体外抗炎活性，并对白色念珠菌、加德纳菌感染所致阴道炎表现出明显药效。
市售的阴道洗液品类较多，疗效不一，许多洗液不仅不能杀灭致病菌，还可能会错杀有益菌，导致阴道菌群失调，而抗生素的滥用会导致病原菌出现耐药性，给后续治疗带来极大影响。
加德纳菌和白色念珠菌是临床上常见的妇科疾病患阴道炎的主要致病菌，因此选择合适的杀菌药物显得尤为重要。
本研究结果显示，妇阴康洗剂具有较好的体外抑制细菌生长作用，作为多组分中药洗剂不易产生耐药性，对阴道菌群优势菌乳杆菌无抑制作用，并对白色念珠菌和加德纳菌局部感染性大鼠阴道炎模型均具有较好药效和抗炎作用，可为临床妇阴康洗剂的用药指导提供依据。
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