《Acta Biomater.》：生物活性玻璃釋放「硅」對細胞反應的影響

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儘管對硅酸鹽生物活性玻璃（SBG）的研究已有50多年的歷史，並取得商業上的成功，發表了6000多篇文章，但人們對SBG中釋放的可溶性硅酸鹽（Si）如何影響細胞反應仍然缺乏了解。

近日，來自英國皇家自由醫院的Gavin Jell教授團隊進行了生物活性玻璃釋放的硅物質對細胞反應影響的相關綜述。成果以「The Effect of Si Species Released from Bioactive Glasses on Cell Behaviour: A Quantitative Review」為題於9月14日發表在《Acta Biomaterials》上。

本文定量比較了文獻中報道的細胞對SBG溶解產物的體外反應，並確定硅濃度（[Si]）是否對細胞行為產生了影響。細胞對溶解產物中SBGs [Si]的反應包括代謝活動（52%的文章有報道）、細胞數量（24%）、蛋白質生成（22%）、基因表達（22%）和生物礦化（24%）。據報道，引起細胞反應增加（理想）的[Si]（中位數=30.2ppm）與引起細胞反應減少（不理想）的[Si]（中位數=52.0ppm）存在差異（P≤0.001）。不良結果的頻率隨着[Si]的增加而增加，超過52ppm的不良結果比[Si]高出約3倍。本文還研究了[Si]對特定細胞行為（如代謝活性、血管生成、骨生成）的影響、細胞類型是否會影響這些反應以及SBG溶解物質中其他離子（Ca、P、Na）對細胞行為的影響。本綜述首次定量比較了文獻中細胞對SBG的反應，提供SBG體外定量的概述，並發現更有可能產生理想細胞反應[Si]的範圍（30-52ppm）。該綜述還表明有必要進一步規範體外研究方法，並提供一些最低標準。

圖1 綜述流程圖

1. 將SBGs與更大的領域進行比較

搜索標準最初確定665篇體外研究文章，排除僅涉及體內數據（20%）、未對細胞對DPs反應進行定量評估（39%，例如細胞形態比較或缺乏未處理對照）或研究[Si]的文章（22%）。用於分析的研究文章以研究骨骼的文章為主（63%），其次是傷口癒合（17%）、牙科應用（12%）、免疫反應（5%）和軟骨（3%）。在初步搜索時收集的文章（n=665）和被選中進行分析的文章中都發現類似的生物基因應用分佈，表明所分析的文章在更廣泛SBG領域具有代表性。

圖2 Prisma圖表明文章篩選過程和文章排除標準

2. 用於分析SBG溶解物質體外反應的方法

人類細胞（占文章總數的59%）、幹細胞（占文章總數的39%）和成骨細胞（占文章總數的34%）是研究SBG DPs及其細胞相互作用最常用的細胞（按物種和細胞類型分別計算）。代謝活性測定是最常描述的細胞結果（68%的文章），可能由於10993 ISO標準建議描述細胞代謝活性對醫療器械的反應。所使用的代謝測定方式差異很大，最常見的是MTT和WST-8測定（分別占文章的51%和29%）。與需要溶劑溶解不溶性晶體的MTT相比，產生可溶性產物的代謝測定（如WST-1、WST-8、Presto和阿拉瑪藍）在過去五年中使用得更頻繁。過去五年中MTT的使用率（占研究代謝活性文章的33%）低於前五年（2016-2011年，佔67%）。雖然大多數文章都使用代謝活性測定法，但只有約2%的文章對該數據（按細胞數計算的代謝活性）進行歸一化處理。只有24%的文章直接測量細胞數量（而不是代謝活性），其中85%的文章對裂解細胞的DNA進行了量化。研究SBG DP相互作用最常用的細胞培養時間點是3個時間點（評估代謝活性時）（1、3、7天的文章佔24%）。約25%的文章使用了2個時間點或更少（1天和2天的文章佔15%）。在分析稱體外骨結節形成或生物礦化的研究中（12%的文章），鈣沉積的量化是最常見的測量方法（90%的文章），而結節面積（7%）和結節數量（3%）則是最常見的結果測量方法。

最常見的生物活性玻璃成分（符合搜索標準）是45S5 Bioglass®（占文章總數的30%），而商業成分S53P4（Bonalive®）占文章總數的3%。體外研究的溶膠玻璃成分為58S和70S30C，分別佔12%和1%，熔融衍生的成分佔1%。約有54%的文章報告在搜索標準中每篇文章獨有的SBG成分，這些文章通常是在研究添加到基本SBG成分中的額外治療性離子（如Co、Sr、Li）的效果。鎂和鍶（均占文章總數的10%）是最常見的附加離子。用於研究SBG DPs與細胞（體外）相互作用的細胞培養基中平均[Si]為37.8ppm±36.6。對某些細胞和物種類型來說，研究人員（平均）使用了不同的[Si]濃度。與非人體細胞相比，人體細胞使用了更高的[Si]濃度；與非幹細胞相比，使用幹細胞的研究使用了更高的[Si]濃度範圍。

3. 硅濃度會影響細胞反應嗎？

綜合所有細胞反應，[Si]濃度對細胞行為有依賴性影響，其中[Si]導致效應增加（正效應）高於無顯著差異的[Si]，但低於導致效應減少（負效應）的[Si]。報告最多的結果是[Si]對細胞反應的影響，與沒有SBGs的未處理對照組相比沒有顯著差異（無變化）。相比之下，有437個[Si]數據點報告的結果明顯增加，157個數據點報告的結果明顯減少。隨着[Si]的增加，出現負面結果的頻率也在增加。在52ppm的[Si]以上，出現負面結果的頻率增加了約3倍。在[Si]為30-60ppm的範圍內，報告的陽性結果的頻率最高。然而，[Si]與細胞反應的程度（與未使用SBG DPs的未處理對照的百分比差異）之間只有很弱的負相關（R=-0.08）。

圖3 生物活性玻璃中釋放的[Si]對細胞行為的影響

4. 細胞類型和種類是否會影響對溶解產物的整體反應？

據報道，對人體細胞造成降低（負面）結果的[Si]平均高於非人體細胞，表明人體細胞可以耐受較高的[Si]濃度。據報道，人類細胞和非人類細胞在導致正面結果的[Si]方面沒有差異。不過，使用人類細胞進行研究發現，[Si]的中位數明顯高於使用非人類細胞進行的研究。因此，人體細胞研究中更高的[Si]範圍可能是造成人體細胞與非人體細胞之間差異的原因，而不是細胞的特定反應。細胞類型（原代細胞與非原代細胞，或幹細胞與非幹細胞）並不影響[Si]對細胞產生的陰性或陽性反應。雖然用於研究原代細胞和非原代細胞的[Si]範圍沒有顯著差異，但用於研究幹細胞的平均[Si]與用於研究非幹細胞的平均[Si]之間存在差異。考慮到[Si]越高，負面影響越大，幹細胞和非幹細胞之間沒有差異，可能表明幹細胞（與非幹細胞相比）對越高濃度範圍的[Si]耐受性越強。

圖4 特定物種細胞對生物活性玻璃和陶瓷釋放[Si]的反應

5. [硅]會影響細胞代謝活動、細胞數量和死亡嗎？

代謝活性是用於分析細胞對SBG DPs反應的最常見細胞檢測方法（52%的文章），其產生的趨勢與細胞總體反應相似，即隨着[Si]的增加，代謝活性反應中出現負反應的頻率增加。使用百萬分之90或以上[Si]的研究並未報告新陳代謝活動增加。值得注意的是，據報道在人類細胞中導致代謝活動降低的[Si]高於導致陽性結果的[Si]，但在非人類細胞中卻沒有觀察到這種情況。在代謝活性、細胞數量或細胞死亡對[Si]的反應方面，沒有觀察到其他物種或細胞類型的特定差異。細胞數量的趨勢與代謝活性類似，[Si]高於40ppm會增加細胞間不良相互作用的頻率。不過，報告的[Si]對細胞數量的增加或減少沒有差別，報告最多的結果是[Si]沒有顯著改變細胞數量。在增加細胞死亡的平均[Si]方面也沒有觀察到明顯差異。不過，隨着[Si]的增加，報告的細胞死亡結果的頻率也在增加，據報告，44%高於60ppm的數據點會導致細胞死亡，而低於60ppm的數據點只有2%。

圖5 生物活性玻璃釋放的[Si]對細胞代謝活動、增殖和細胞死亡的影響

6. [Si]對成骨和血管生成反應有影響嗎？

在[Si]與成骨細胞分化標誌物（骨鈣素和ALP活性）、生物礦化或血管內皮生長因子產生之間沒有觀察到明顯差異。如果只考慮幹細胞的分化（9篇文章），情況也是如此，即[Si]與成骨/血管生成的增加或減少沒有差異。鑒於成骨分化不同階段ALP表達的差異，還考慮了細胞培養時間的影響。在分析的任何時間點（一周、兩周或三周）都沒有觀察到ALP活性的差異。然而，報道ALP活性因[Si]而增加的文章比ALP活性降低的文章多3倍。大多數研究（70%的文章，75%的數據點）將ALP酶活性與細胞數量（DNA總量）或蛋白質總量歸一化，但只有33%的文章（30%的數據點和文章）將骨鈣素或血管內皮生長因子的產生與細胞數量歸一化。在沒有歸一化的情況下，很難確定[Si]對ALP活性的影響是由於細胞數量差異還是由於單個細胞的反應。不過，[Si]對ALP歸一化或非歸一化數據的影響沒有差異。有幾種不同方法用於確定生物礦化度，其中最常用的是茜素紅染色法，其次是元素分析法和結核（數量和面積）量化法。通過氯化十六烷基吡啶萃取法（最常用的量化方法）量化鈣量的文章中，[Si]與鈣沉積之間沒有關係。將所有基因表達對[Si]的反應綜合起來，與其他細胞反應類似，與基因表達減少相關的平均[Si]高於導致基因表達增加的[Si]。研究中最常見的基因與成骨分化（如RUNX-1、OSX、BSP、ALP、BMP）、細胞外基質（ECM）生成（I型膠原）或血管生成（血管內皮生長因子）有關，這些基因表達的增加通常代表組織再生狀態。當[Si]較高時，VEGF、ALP、OCN、OSN、RUNX-2和膠原T1的基因表達量減少，但OSX和BSP的基因表達量出現相反的情況。

圖6 [硅]對不同細胞類型特異性反應的影響

7. SBG的類型會影響細胞反應嗎？

為各種醫療應用生產了不同的SBG成分，但尚不清楚BG類型與體外細胞結果之間是否存在共性。在數據集中，最常用的SBG成分是熔融衍生的45S5 Bioglass®（23篇文章），其次是溶膠衍生的58S（9篇文章）。比較了所有熔融衍生的BG（僅含Si、Ca、P、Na）、45S5 Bioglass®、58S玻璃和含有額外治療離子（如Sr、Co、Mg）的玻璃對細胞的影響。與其他類型的玻璃相比，在[Si]較高的情況下，細胞對58S DPs會產生負向或正向反應。不過，58S研究中的[Si]範圍高於其他SBG。研究發現，其他治療離子會改變細胞對[Si]濃度的反應，與45S5相比，[Si]濃度越低，細胞反應越好；與45S5相比，[Si]濃度越高，細胞反應越消極。考慮到Si和治療離子是按比例釋放的，可能表明治療離子對細胞反應的影響。

圖7 玻璃類型和[Si]

8. 鈣、鈉和磷離子對BG溶解產物的影響

除[Si]之外，SBG釋放的其他離子濃度也可影響細胞的相互作用。因此，本文還比較了鈣、磷和鈉（分別為[Ca]、[P]和[Na]）濃度對細胞行為的影響。與[Si]濃度對細胞行為的影響相反，據報道對細胞有負面影響的[P]濃度低於有正面影響的[P]濃度。[Na]對細胞也有類似的影響，與產生積極影響的[Na]中值相比，產生消極影響的[Na]中值較低。在[Ca]對細胞行為的影響方面沒有發現明顯差異。接着還研究了這些離子是否會影響硅對細胞行為產生影響的濃度。將每種離子（[Ca]、[P]、[Na]）的濃度範圍分成大小相同的"高"、"中"和"低"組。在SBG中發現，細胞對[Si]的反應與在所有數據中觀察到的類似，[Si]濃度越高，結果越負面。然而，"低"[Ca]組（41.6-0ppm）與高[Ca]組（125-83ppm）相比，[Si]導致的負面結果與正面結果之間的平均值差異更大，表明鈣可能會影響[Si]對細胞行為的影響。此外，[磷]似乎有相反的作用，在SBG培養基磷含量較高的組中，細胞對[Si]的反應差異較大（報告的負面或正面效應的差異），而[磷]濃度"低"（13.3-0 ppm）的組中，細胞對[Si]的反應沒有差異。在任何組別中都沒有觀察到[Si]和[Na]之間的明顯趨勢。

圖8 [Ca]、[Na]和[P]對細胞整體反應的影響

9. 研究單獨的Si種類和BG溶解產物對細胞行為的影響差異

為研究硅離子是否能獨立於BG中釋放的其他離子（Na、Ca和P）影響細胞反應，本文收集了更多關於硅離子（非BG DPs產生）單獨影響的文章（22篇）。與BG條件培養基類似，隨着[Si]的增加，單獨的Si離子也會導致越來越多的負面結果。據報道，導致負面結果的[Si]中位數與導致無變化的[Si]中位數和導致正面結果的[Si]中位數有顯著差異。與SBG DPs對[Si]的反應相比，這些硅濃度明顯較低。然而，單獨使用硅離子時的[Si]範圍與DPs中的[Si]範圍相比存在差異，可能是解釋SBGs DPs與單獨使用硅之間差異的一個干擾因素。硅酸鈉是調節細胞培養基最常見的硅前體（65%的文章），氯化硅（13%）和硅酸鈣（8%）也被研究過。在硅源和細胞結果之間沒有發現差異。

圖9 非溶解產物中的硅對細胞反應的影響

10. 總結與展望

本綜述首次嘗試量化生物活性玻璃中釋放的硅對體外細胞反應的影響。定量分析顯示，SBG DPs中[Si]含量越高，報告的負面結果出現頻率就越高，但更有可能出現負面結果的特定濃度以及更有可能出現理想細胞反應的[Si]濃度，對於調整新型SBG的硅釋放量非常有用。本研究採用的方法也是一種新穎的方法，可用於比較方法差異較大的複雜研究（如不同的細胞類型、實驗條件和用於評估細胞反應的方法）。BGs體外表徵方法的標準化會讓人們更深入了解[Si]的濃度依賴效應，並理解其在細胞反應中的各種作用。

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