目前，實驗室和臨床最常使用的幾種免疫檢測方法中包括酶聯免疫吸附法（Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay，簡稱 ELISA）和酶聯免疫斑點法（Enzyme Linked Immunospot Assay，簡稱 ELISPOT），但這兩種檢測方法存在一定的局限性。例如，ELISA 和 ELISPOT 一次只能檢測一個抗原或抗體靶標，而且無法檢測低濃度的樣品，檢測靈敏度也不夠高。
為改善以上兩種檢測技術的不足之處，蘇州大學藥學院藥劑系劉密教授團隊研發了 FOLISA 和 FOLISPOT 兩種基於 DNA 條形碼和 DNA 互補配對放大法的免疫檢測新技術，實現了信號放大和同時多靶點檢測。
圖 | 劉密（來源：劉密）
該團隊介紹，FOLISA 和 FOLISPOT 不僅能夠同時檢測多個抗原或抗體靶標，而且檢測靈敏度遠高於傳統的 ELISA 和 ELISPOT，FOLISA 可以到達 fg 級別，檢測到 ELISA 法無法檢測到的信號，而 FOLISPOT 可以檢測到 ELISPOT 法無法檢測的僅分泌少量抗原的細胞。
近日，相關論文以《一種用於免疫吸附測定和免疫斑點測定的多目標同時檢測方法》（A Multiple-Target Simultaneous Detection Method for Immunosorbent Assay and Immunospot Assay）為題，作為當期封面文章發表在 Analytical Chemistry 上，劉密擔任通訊作者，蘇州大學藥學院藥劑系 2021 屆碩士生馬建婷為共同一作[1]。
圖 | 論文封面（來源：Analytical Chemistry）
據了解，ELISA 和 ELISPOT 一次只能檢測一個靶標的主要原因是，這兩種技術使用的是酶和底物信號放大法，一旦底物被酶催化顯色後，同一個檢測孔就無法再進行後續檢測了。
而此次提出的免疫測定技術 FOLISA 和 FOLISPOT，在檢測血清樣本時能夠進行多輪檢測，每一輪可檢測多個抗原。具體來說，FOLPISPOT 可以多輪檢測分泌幾種不同細胞因子的細胞，以分析各類型細胞同時分泌不同細胞因子的情況；FOLISPOT 可以用來檢測僅分泌很少量細胞因子的細胞，如分泌 TGF-β 等細胞因子的細胞，且檢測靈敏度遠高於 ELISPOT。
研究人員表示，FOLISA 和 FOLISPOT 是通過 DNA 條形碼和 DNA 互補配對法，檢測抗體上連有特定 DNA 序列的 DNA 條形碼，DNA 放大鏈和 DNA 檢測鏈可以依次實現 DNA 互補配對以放大帶檢測靶標的信號。而且，這兩種技術的檢測靈敏度通過優化還可以進一步提高。
據悉，這兩項技術中的信號放大系統是通過將 DNA 多聯體與 DNA 偶聯檢測抗體連接來實現的，其中 DNA 多聯體的長度與檢測靈敏度有直接影響。通過調節反應參數能夠改變 DNA 多聯體的長度，從而控制整個檢測系統的靈敏度。
值得一提的是，除了檢測靈敏度，FOLISA 和 FOLIPSOT 的檢測特異性和選擇性也非常高。此外，通過研究人員的精巧設計，被檢測後的信號可以在被依次洗脫後對同一樣品進行多輪檢測，這使得其在每輪檢測中的檢測靶標數量獲得二次提升。
（來源：Analytical Chemistry）
研究中，由於 FOLISA 在測量單個靶蛋白方面表現出高靈敏度，該團隊對這項技術展開了進一步的深入分析。他們使用具有單級信號放大系統的 FOLISPOT 檢測了四種不同類型的靶蛋白，使⽤具有雙級信號放大系統的 FOLISPOT 檢測了六種不同類型的靶蛋白。
結果表明，與單級信號放大系統的 FOLISPOT 相比，具有雙級信號放大系統的 FOLISPOT 檢測靈敏度更高，可用於分析比強活化細胞分泌更少抗原的弱活化細胞。
此外，為驗證 FOLISA 在實際應用中是否會受到血清中各種成分的干擾，該團隊測量了血清中細胞因⼦的濃度，然後得出，使用 FOLISA 多途徑同時檢測人血清中六種細胞因子，與傳統 ELISA 方法單獨檢測這六種細胞因子的效果沒有顯著差異。
圖 | 使用 FOLISA 進行樣品分析示意圖（來源：Analytical Chemistry）
總體而言，無論是對於實驗室樣本檢測還是潛在的臨床樣本檢測來說，FOLISA 和 FOLSPOT 都為其快速、高靈敏度和多重檢測的抗原或抗體提供了有效和通用的平台。而且，與現有技術 ELISA 和 ELISPOT 相比，這兩項新技術不僅更靈敏、更高效，而且更節省人力和成本。
劉密表示，「我們相信，這種快速高效、多靶標、高靈敏度、高特異性的免疫檢測技術，優於傳統的 ELISA 和 ELISPOT 免疫測定技術，並有望在今後的實驗室科研研究及臨床免疫檢測領域發揮重要作用。」
據了解，劉密主要專註於預防性和治療性癌症疫苗、mRNA 疫苗遞送技術和免疫多靶點檢測技術等方面的研究，並擁有預防和治療性癌症疫苗、mRNA 疫苗遞送技術、免疫多靶點檢測技術等國際專利和國內發明專利二十多項。
他是蘇黎世瑞士聯邦理工學院藥學院藥劑系的博士，還曾在哈佛大學醫學院免疫系從事博士後研究。2018 年 12 月份加入蘇州大學後，至今一直在該校藥學院藥劑系任特聘教授和博士生導師。
-End-
參考：
1.Jianting Ma et al. A Multiple-Target Simultaneous Detection Method for Immunosorbent Assay and Immunospot Assay. Analytical Chemistry （2022）
https://doi.org/10.1021/acs.analchem.2c01087
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