從細胞或組織（新鮮或冷凍）中提取蛋白質的所有步驟必須在2-8°C下進行。以下是用於製備蛋白質樣品的一種常見裂解緩衝液的成分。更多內容請到默克生命科學官網查看：www.sigmaaldrich.cn
用於蛋白質提取的RIPA緩衝液即用型溶液（貨號：R0278）
NaCl (貨號：S3014) 150mM
Triton X-100 (貨號：T8787) 1%
脫氧膽酸鈉(貨號：D6750) 0.5%
SDS (貨號：74255) 0.1%
Tris-HCl (貨號：T1503) pH 8.0, 50 mM
蛋白質提取實驗方案步驟
將含有細胞的培養皿中的培養基丟棄，用冰冷的PBS洗滌細胞。
丟棄PBS，加入冰冷的裂解緩衝液。
使用冷塑料細胞刮刀刮擦細胞。收集微量離心管中的細胞。
將微量離心管中的內容物在4℃下攪拌30分鐘。
將離心管在4℃下以16,000G離心20分鐘。將上清液收集在新管中並置於冰上。丟棄沉澱物。
從細胞懸液提取蛋白質
將細胞懸液在4℃下以2,000G離心5-7分鐘。細胞將聚集於試管底部，棄去上清液。
向細胞沉澱中加入冰冷的PBS，並在4℃下以2,000G離心5-7分鐘洗滌細胞。
向細胞沉澱中加入冰冷的裂解緩衝液。將微量離心管中的內容物在4℃下攪拌30分鐘。
將離心管在4℃下以16,000G離心20分鐘。將上清液收集在新管中並置於冰上。丟棄沉澱物。
從組織中提取蛋白質
在冰上切割要研究的組織。將組織轉移到圓底離心管，浸入液氮快速冷凍。
對於5 mg組織，加入300 μL冰冷的裂解緩衝液，使用電動勻漿器均化。在均質化過程中另再添加300-600 μL裂解緩衝液。
在4℃下攪拌內容物2小時。
將離心管在4℃下以16,000G離心20分鐘。將上清液收集在新管中並置於冰上。丟棄沉澱物。
標準化樣品總蛋白質濃度
取少量裂解物進行蛋白質估算測定。
蛋白質估算可以使用考馬斯蛋白質測定試劑（貨號：27813）、BCA 測定、280nm吸光度、或用於總蛋白定量的DirectDetect® 紅外光譜儀進行。
通過與標準樣品比較確定未知樣品的蛋白質濃度，確保將標準樣品稀釋到與未知樣品相同的緩衝液中。
將適當體積的裂解物轉移到微量離心管中，使得所有樣品都含有相同的總蛋白質濃度。
加入足夠的冰冷裂解緩衝液，使所有裂解物具有相同的體積。
將樣品與Laemmli上樣緩衝液混合
以下是製備電泳樣品所需的上樣緩衝液的成分。
2X Laemmli上樣緩衝液
溴苯酚藍（貨號：B5525）0.004% 0.004%
2-巰基乙醇 10%
甘油（貨號：G5516）20%
SDS（貨號：74255）4%
Tris-HCl（貨號：T1503）0.125 M
向一定量的細胞裂解物中加入等量的上樣緩衝液。
將上述混合物在95℃下煮沸5分鐘。以16,000G離心5分鐘。
這些樣品可以在-20°C下儲存，也可以用於進行凝膠電泳。
