人基因組中存在大量重複序列，包括長散布核元件-1（LINE-1）逆轉錄轉座子，人內源性逆轉錄病毒（HERV），衛星重複序列等。
正常發育過程中，重複序列主要在胚胎髮育期間表達，在已分化的組織中被抑制[1]。而在腫瘤的發生髮展過程中，重複序列異常表達[2]，而且這些異常表達的重複序列RNA可逆轉錄為DNA，導致腫瘤細胞胞漿DNA積累，從而激活cGAS-STING通路促進腫瘤進展[3]。
這意味着抑制逆轉錄酶活性，可能影響腫瘤進展和轉移播散。實際上，核苷類逆轉錄酶抑製劑目前已經在臨床上用於治療HIV和HBV感染。那麼，這些藥物能否用於對付腫瘤呢？
近日，由美國哈佛大學醫學院附屬麻省總醫院David T. Ting和Benjamin D. Greenbaum領銜的研究團隊，在著名期刊Cancer Discovery雜誌發表的最新研究[4]，回答了前述問題。
他們利用核苷類逆轉錄酶抑製劑拉米夫定（3TC）在結直腸癌模型中進行了功能研究和機制探索，並在轉移性結直腸癌患者中進行臨床試驗，發現3TC具有抑制腫瘤進展的潛力。
論文首頁截圖
實際上，Ting團隊之前研究過核苷類逆轉錄酶抑製劑扎西他賓（ddC）和司他夫定（d4T）在體內外抑制結直腸癌細胞生長的效果，雖然這兩個藥物也有效果，但是這些早期的核苷類逆轉錄酶抑製劑對患者有嚴重副作用[5]。這顯然不適合應用於臨床。
為了找到有療效，且副作用小的逆轉錄酶抑製劑，這一次他們選擇了3TC進行試驗。這是因為已有研究證明3TC具有抑制內源性逆轉錄酶活性的潛力，而且HIV和HBV患者對這個藥物的耐受良好。
考慮到腫瘤細胞的遷移和避免離開大本營自發凋亡（失巢凋亡）的能力是腫瘤轉移必需的。因此研究人員首先進行了Transwell遷移實驗和軟瓊脂克隆形成實驗，探究3TC對10種結直腸癌細胞系（p53突變型：DLD1，HCT15，HT29，C2BBe1，LS123和SW948；p53野生型：HCT8，HCT116，LOVO和RKO）轉移的影響。
Transwell遷移實驗結果表明，3TC顯著抑制DLD1，HCT15，C2BBe1，LS123和RKO細胞系遷移。不難發現，3TC主要作用於p53突變型細胞系。軟瓊脂克隆形成實驗也觀察到類似的結果。進一步，研究人員發現3TC對p53突變型SW620荷瘤小鼠有療效，而對p53野生型HCT116荷瘤小鼠無效。
(L)和(M)分別是p53突變型（SW620）和野生型（HCT116）結直腸癌荷瘤小鼠給予3TC或PBS處理後腫瘤生長曲線。
觀察到3TC主要對p53突變型細胞系或荷瘤小鼠有效後，研究人員接着探究p53是否對重複序列表達有直接影響。
研究人員在p53突變型（SW620，DLD1）和野生型（HCT116，HCT8）細胞系中進行p53免疫沉澱測序。差異富集分析發現，兩種細胞系中p53結合的重複序列中衛星重複序列（SAT）和LINE-1差異明顯。p53突變型（SW620，DLD1）細胞系均存在DNA結合功能域位點突變，提示p53結合DNA功能的丟失和p53-重複序列互作減少相關。
通過RNA測序和染色質免疫共沉澱測序，研究人員發現LINE-1重複序列亞家族L1PA2在p53野生型和突變型細胞系中差異表達。利用RNA原位雜交技術，他們發現人類衛星II（HSATII）衛星重複序列在p53突變型細胞系中顯著高表達。
(C)p53突變型和野生型細胞中p53結合的重複序列差異表達圖。LINE，Statellite和ERV是三種主要的重複序列類型；(E) p53突變型和野生型細胞中HSATII RNA原位雜交代表圖和統計圖。
鑒於臨床前研究發現3TC主要作用於p53突變型結直腸癌細胞，研究人員進行了3TC治療p53突變的轉移性結直腸癌II期單臂臨床試驗（NCT03144804）。試驗入組條件包括p53突變的難治性轉移性結直腸癌，進展或不耐受5-氟尿嘧啶（5-FU）、奧沙利鉑和伊立替康，及抗EGFR治療（RAS野生型）；年齡≥18周歲，具有組織學或細胞學記錄的晚期（轉移或不可切除）患者，在至少兩種系統治療方案中無法治癒且疾病進展。
最終共有32名患者被納入這個研究。首批9名患者以28天為一個周期，每日口服2次3TC，每次150mg。9名受試患者評估安全後，剩下的23名患者將劑量增至每次600mg。每8周進行一次腫瘤評估，直到根據RECIST標準或藥物不耐受評估為疾病進展。
從治療效果來看，疾病穩定（SD）的患者有8名（25%，Pts 7，8，11，15，20，28，31，34），他們的中位無進展生存期為149天。其中患者Pt 20無進展生存期最長，達到230天。
從治療的安全性來看，無5級不良事件發生，大多數受試患者的不良事件為3級（18/32，56.3%），例如淋巴細胞數量減少（11/32，34.4%）等。不過大部分3級不良事件是腫瘤惡性進展或臨床試驗前的系統性治療導致的，3TC治療相關的3級不良事件極少，包括貧血（1/32，3.1%）和腹瀉（2/32，6.3%）等。
(A)臨床試驗設計；(B) 32名受試患者試驗結果統計。
為了探究3TC療效是否和重複序列表達有關，研究人員評估了受試患者治療前的樣本。
他們對其中30名患者治療前樣本進行RNA-seq，結果表明所有受試患者均高表達多種重複序列RNA，且腫瘤中均存在p53突變。他們用免疫組化技術評估了其中28名患者腫瘤樣本的LINE-1蛋白表達情況，發現SD患者LINE-1蛋白水平顯著低於PD患者，表明PD患者中LINE-1逆轉錄酶活性足夠克服試驗所用劑量的3TC。
由於免疫組化檢測的是腫瘤原位LINE-1蛋白，只能反應腫瘤原發灶，而不能反應患者全身的腫瘤負荷變化情況，因此研究人員利用蛋白質超敏檢測技術（Simoa）檢測到了外周血LINE-1蛋白。
他們發現SD患者相較於PD患者，其血漿LINE-1水平顯著降低，這可能提示腫瘤負荷的差異，意味着3TC單葯可能無法對抗具有高逆轉錄酶活力的腫瘤。總的來看，3TC治療後疾病穩定和LINE-1蛋白基線水平低有關，而和重複序列RNA表達或者體細胞逆轉錄轉座無關。這說明3TC是在重複序列RNA生命周期中逆轉座整合至基因組前發揮作用。
(G)免疫組化檢測受試患者腫瘤樣本中LINE-1蛋白表達水平；(H) 受試患者血清LINE-1蛋白含量。
為了更好地理解3TC對結直腸癌的作用，研究人員利用RNA測序分析了13名受試患者配對的治療前和治療中的樣本，發現經過治療腫瘤患者重複序列表達顯著降低。GO分析發現干擾素應答基因顯著上調。
已有報道干擾素應答可能和感知重複序列的RNA和DNA有關[3]。於是研究人員假設3TC治療可能改變重複序列cDNA或逆轉錄形成的RNA:DNA雜交分子含量。他們利用定量免疫熒光檢測腫瘤細胞胞漿雙鏈DNA或RNA:DNA雜交分子含量，結果發現3TC處理後的p53突變型（SW620，DLD1）細胞系中雙鏈DNA含量顯著降低，而RNA:DNA雜交分子含量顯著增加。
(E)和(F)分別是免疫熒光檢測3TC或DMSO處理後的p53突變型（SW620，DLD1）結直腸癌細胞胞漿dsDNA含量和RNA:DNA雜交分子含量的代表圖和統計圖。
已知STING是胞漿DNA和RNA:DNA雜交分子的識別受體，在DLD1細胞系中敲降STING後可部分減弱3TC的抗遷移作用。這些結果說明3TC可能通過調節胞漿核酸分子含量激活STING信號，從而抑制細胞遷移。
既然p53突變使重複序列表達活化，從而使3TC有發揮作用的空間，那麼解除對重複序列的沉默促進其表達，能否進一步增強3TC的療效或應用範圍呢？
考慮到DNA甲基化是重複序列表達沉默的原因之一[2]，於是研究人員聯合使用DNA去甲基化藥物阿扎胞苷(AZA)和核苷類逆轉錄酶抑製劑，發現二者聯用可促進細胞壞死，從而降低腫瘤生長，且在p53野生型和突變型腫瘤中均有作用。
聯合用藥靶向調控重複序列表達的原理圖
那麼這種聯用效果是否由重複序列介導的呢？研究人員聚焦於前述提到的人類衛星II（HSATII）衛星重複序列，利用反義核酸LNA[5]靶向HSATII，發現p53突變型（SW620，DLD1）細胞系發生壞死，從而導致癌細胞的生長被抑制。這些結果表明重複序列介導的干擾素應答和細胞壞死是這些藥物的可能作用機制。
研究人員對3TC的作用機制探究並未止步於此。他們用3TC處理p53突變型細胞系後進行RNA測序分析，結果發現除了前述提到的先天免疫和干擾素應答基因上調外，DNA損傷應答相關基因也顯著富集。
在5-氟尿嘧啶/奧沙利鉑（5FU/Oxa）聯合處理的結直腸癌細胞系和經過放化療的結直腸癌患者樣本中，研究人員發現HSATII衛星重複序列高表達。因此，研究人員嘗試3TC聯合5FU/Oxa處理腫瘤細胞，結果顯示更高的細胞毒性。
火山圖顯示3TC或DMSO處理後的p53突變型細胞系差異富集基因。DDR：DNA損傷應答相關基因；IFN：干擾素應答相關基因。
總的來說，這個研究表明，結直腸癌會表達豐富的具有類似病毒生命周期的重複序列，常用的抗病毒核苷類逆轉錄酶抑製劑有望成為腸癌治療藥物。
值得一提的是，3TC治療p53突變的轉移性結直腸癌Ⅱ期單臂臨床試驗提示3TC治療可能使部分患者獲益，為後續NRITs聯合化療等治療腸癌奠定了基礎。
機制示意圖
此外，這項研究也提示我們重複序列等基因組中的「暗物質」，在腫瘤發生進展中的作用有待深入探究，這將有助於我們找到更多的腫瘤靶點和聯合治療策略。
