了解自噬研究的經典思路

自噬是熱點熱點之一。現解讀一下“炎症性相關疾病中的自噬”在課題設計中研究思路。

一、研究背景

非小細胞肺癌（NSCLC）是一種常見的惡性腫瘤，肺癌患者從診斷時起的平均生存時間很短。因為由於腫瘤擴散、侵襲、遠處轉移和對化療藥物的敏感性有限，治癒性治療通常不可行。因此，探討“提高非小細胞肺癌抗腫瘤藥物敏感性的機制”已成為當務之急。

自噬在細胞的生長、發育、分化、衰老、耐葯和細胞死亡等過程中起着重要作用。自噬，即可抑制腫瘤，也可以促進腫瘤在營養有限和低氧條件下生存。

YBX1（Y-box binding protein 1）是一種多功能蛋白，通過與靶基因啟動子處的倒置的CCAAT盒結合來調控轉錄，在腫瘤侵襲轉移、耐葯、細胞增殖和DNA修復等方面發揮重要的促癌作用。最近的研究表明，YBX1與妊娠期肝內膽汁淤積症的自噬有關。然而，YBX1與NSCLC自噬的關係及其分子機制尚未闡明。

在本研究中，作者發現：① 自噬相關蛋白 LC3I/II 的表達與 NSCLC 組織樣本和細胞中 YBX1 的表達密切相關，根據假設，LC3I/II 受 YBX1 控制；② YBX1的過表達會導致體外和體內自噬的上調；③ YBX1 的敲低通過調節自噬，增強了順鉑的抗腫瘤作用；④ YBX1 能通過p110β/Vps34/beclin1通路促進自噬，這表明 YBX1/p110β/Vps34/beclin1 軸參與了癌症的發展和 NSCLC 的進展。

二、研究方法及結果

1. YBX1和自噬相關蛋白LC3I/II在NSCLC病人中的差異表達

作者首先利用western immunoblot分析NSCLC患者組織及NSCLC細胞中的YBX1和LC3I/II在NSCLC表達量，結果發現兩種蛋白都高表達，說明YBX1與自噬有關。

2.YBX1促進自噬的發生

作者分別構建了YBX1過表達 A549、Hcc827細胞和敲減的H1299、H460細胞，利用western immunoblotting、自噬雙標腺病毒(mRFP-GFP-LC3)和自噬誘導或者抑製劑分析YBX1與自噬的關係。

首先，western immunoblotting分析發現，YBX1的表達量降低顯著抑制了LC3I/II的表達量，在過表達的細胞中發現了相反的現象。接着，利用免疫熒光和透射電鏡的超微結構分析感染了GFP-LC3中Autophagosome的形成情況，發現YBX1促進了自噬Autophagosome的形成。最後，利用自噬誘導或者抑製劑分析YBX1過表達和敲減的細胞系中GFP-LC3或GFP-LC3II轉換，發現YBX1過表達能促進GFP-LC3的形成。

3.YBX1介導自噬的機制分析

自噬的信號通路有PI3K/Akt/mTOR 和 p110 β/Vps34/beclin1，通過分析在YBX1過表達和敲降細胞系中關鍵信號分子的表達量，作者確定YBX1是通過調節p110 β/Vps34/beclin1來控制自噬的發生。

考慮到YBX1是一個著名的轉錄激活子，所以通過進一步Jaspar分析得知，YBX1是通過與p110β啟動子結合來發揮作用，並通過pulldown assay進一步驗證了兩者的結合關係。為了進一步確定“YBX1調節p110β是在轉錄水平而不是在蛋白質水平”，作者利用actinomycin D來抑制 RNA polymerase I的YBX1過表達的腫瘤細胞中p110β的表達水平，結果發現YBX1的高表達並沒有引起p110β mRNA的顯著性衰減。通過回復實驗，作者進一步驗證了YBX1-mediated p110β的自噬。

4. YBX1通過誘導自噬作用降低順鉑介導的NSCLC細胞增殖抑制和促進細胞凋亡的作用

已知YBX1在順鉑耐葯細胞系中明顯高于敏感細胞系，研究者進一步用順鉑處理NSCLC細胞系，發現YBX1, LC3I/II conversion的增長趨勢呈時間依賴性。用順鉑處理YBX1過表達和敲降細胞系時發現，YBX1顯著降低順鉑介導的細胞活性抑制作用同時能夠抑制細胞凋亡。在敲降的細胞系中，作者也發現了C-Caspase 3/9的表達量增加，而Bcl-2 和Caspase 3表達量降低，說明凋亡被激活。該結果表明，敲除YBX1可增強順鉑在非小細胞肺癌中的抗增殖作用。

為了進一步研究 YBX1 調節NSCLC對順鉑的敏感度的機制，作者在YBX1敲降細胞中進一步降低了Bcl-2的表達，發現在NSCLC細胞中同時敲降掉YBX1和 Bcl-2能夠顯著增加對藥物的敏感度。

已經有文獻表明，Bcl-2作為一個抗凋亡蛋白通過beclin1來抑制自噬的發生。作者進一步檢測了YBX1敲降能夠引起Bcl-2和LC3I/II降低，而Bcl-2降低能夠更加顯著的增加LC3I/II的表達量，說明YBX1調節的NSCLC細胞對順鉑的敏感度與自噬有關。

5.體內實驗

研究者使用皮下注射構建YBX1過表達小鼠模型，分析小鼠移植瘤變化。然後加入順鉑處理小鼠，發現YBX1過表達的老鼠對順鉑的敏感度較低。IHC、WB檢測腫瘤塊中YBX1的表達量。其結果顯示YBX1過表達顯著增加了p110β, beclin1, LC3I/II的表達量。

6.臨床樣本檢測

作者利用IHC檢測YBX1和LC3I/II在肺癌組織中的表達量與患者預後的關係，發現YBX1高表達生存率小，但是LC3I/II對患者的預後沒有相關性。另外，還觀察到YBX1與LC3I/II 的正向關係。

四、總結

本研究證明，NSCLC 細胞和組織標本 YBX1 和 LC3I/II表達顯著增高。YBX1 過表達後，在體外和體內都顯着促進自噬。YBX1 通過部分誘導自噬來降低對順鉑的敏感性，而不僅僅是通過增加 Bcl-2 的表達。

進一步的綜合分析表明， p110β 是受 YBX1 調節以介導自噬的關鍵效應物。這些分析說明了 p110β/Vps34/beclin1 信號在自噬中的關鍵作用以及 p110β 在 YBX1 介導的 p110β/Vps34/beclin1 轉錄調控中的不可或缺的關係。作者首先通過體內體外實驗證實YBX1過表達能促進自噬，然後發現YBX1通過誘導自噬降低了對順鉑的敏感性，最後研究進一步的機制：YBX1通過p110β/Vps34/beclin1進行轉錄調節。整個研究思路非常清晰經典，值得大家學習。

來源：https://www.nature.com/articles/s41419-020-2555-4#Sec18