大家好，今天分享的是一篇2025年12月发表在Food Chemistry上的“Tannase-catalysed gallic acid release for clean-label inhibition of green tea auto-oxidative browning”
该文章利用单宁酶催化水解绿茶中天然存在的没食子酰类结合物，原位释放没食子酸，通过降低茶汤pH来抑制氧化褐变。借助UHPLC-HRMS与NMR等技术，在绿茶中鉴定出75种没食子酰化合物，系统阐明了单宁酶对底物骨架、立体构型及取代位置的选择性规律。结果显示，酶处理可释放91.7%的结合态没食子酸，将pH降至4.6，显著减轻褐变。该方法无需外源添加剂，为即饮绿茶提供了绿色、安全的货架期稳定化新策略。
1
天然酚类化合物
天然酚类化合物没食子酸可以作为茶叶的自氧化供体。在茶中，没食子酸（GA）主要以束缚态形式存在。没食子酰化是指没食子酰基与各种支架的连接，通常通过一个酯键连接。在绿茶中，这些支架包括黄烷-3-醇(图1a)，原花青素(图1b)，有机酸(图1c)和葡萄糖(图1d)。没食子酰化化合物如表没食子儿茶素没食子酸酯、表儿茶素没食子酸酯、茶棓素和没食子酰葡萄糖衍生物，通常被称为水解单宁。因此，绿茶中天然含有种类繁多的没食子酰化成分化合物，以及一些游离的GA。结合的没食子酸部分作为没食子酰化化合物的一部分，在绿茶中具有潜在的可降解GA的能力。
作者研究了单宁酶催化释放的没食子酸能否用于抑制RTD绿茶中的自氧化细菌。利用超高效液相色谱(UHPLC)结合高分辨质谱(HRMS)对绿茶中的没食子酰基化合物进行了全面的鉴定，包括诊断性成素依赖性化合物的发现。检测了单宁酶对这些没食子酰基化合物的水解能力。定量分析了单宁酶催化的GA释放酶，以及它对茶叶pH和自氧化细菌的影响。
图1
2
对可水解的合金化合物进行表征
作者通过UHPLC - HRMS和酶水解相结合的方法，实现了对单宁酶水解能力的筛选。首先对超高效液相色谱-高分辨质谱（UHPLC-HRMS）分析获得的二级质谱（MS²）碎片数据进行筛选，寻找与结合态没食子酸（GA）基团相关的特征碎片离子与中性丢失（NL）信号。通常，含1个、2个或多个没食子酸基团的没食子酰化化合物会出现以下特征中性丢失：丢失没食子酸基团（152.01096u，C₇H₄O₄），或丢失没食子酸基团+水分子（170.02152u，C₇H₆O₅），并同时产生特征碎片离子m/z 169.01425（C₇H₅O₅，没食子酸离子）。将高分辨质谱（HRMS）测得的候选没食子酰化化合物的元素组成或碎片信息与文献或人类代谢组数据库进行比对，或将其保留时间与质谱数据与商业标准品或实验室自制纯化标准品进行比对，从而完成候选物质的定性鉴定。
其次，采用无花果曲霉单宁酶进行酶解处理，以验证这些没食子酸（GA）基团是否可被水解。利用文章中建立的分析方法，在混合绿茶中共鉴定出约70种含没食子酰基的化合物，这些化合物具有多种母核骨架。所有以黄烷-3-醇或二聚黄烷-3-醇为骨架的没食子酰化化合物，以及大多数以己糖或有机酸为骨架的没食子酰化化合物，均被证实可被水解（图2a），但单宁酶对这些化合物的水解偏好性存在明显差异。基于该实验，单宁酶对已鉴定的可水解没食子酰化化合物的偏好性以t¾表示，即化合物被水解75%所需的时间。为定量比较单宁酶对不同没食子酰化化合物的水解偏好，按t¾将其划分为5个等级：极佳（<30min）、良好（30–60min）、中等（60–120min）、较差（120–300min）、极差（>300min）（补充材料Ⅱ）。
单宁酶处理300min后，初始黄烷-3-醇峰面积仅剩余0.1%，二聚黄烷-3-醇仅剩余0.2%，处理1140min后这些化合物可完全水解（图2）。然而，以葡萄糖和鞣花酰葡萄糖为骨架的可水解单宁，300min后仍剩余43.2%，1140min后仍有33.3%未被水解。对于没食子酰化有机酸，300min后峰面积剩余59.1%，1140min后仍剩余19.9%。
图2
3
单宁酶对黄烷-3-醇的偏好性
表儿茶素没食子酸酯（ECg）及其差向异构体儿茶素没食子酸酯（Cg），以及表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCg）及其差向异构体没食子儿茶素没食子酸酯（GCg），是混合绿茶中主要的天然单没食子酰基化黄烷-3-醇，其峰面积约占没食子酰化类化合物总UHPLC‑HRMS峰面积的63.4%。四种没食子酰化黄烷-3-醇均可在300分钟内完全水解，但t¾（75%水解时间）存在明显差异（图3a）。根据t¾值，这四种主要黄烷-3-醇的水解效率可划分为：ECg（极佳）对Cg（中等），EGCg（良好）对GCg（较差）。因此，表型异构体（epi‑型）的水解速率显著快于其对应的非表型异构体。
具有两个没食子酸酯部分的黄烷-3-醇，即单体黄烷-3-醇双没食子酸酯，在绿茶中也有少量存在(占混合没食子酸酯化合物总UHPLC-HRMS峰面积的1.5%)。从Aspergillus ficuum的单宁酶菌株的代谢产物中分离出单一的黄烷-3-醇二联体，其t¾值一般小于30min，从而导致单宁酶菌株在30min内接近完全水解(图3b)。黄烷-3-醇双没食子酸酯类化合物的降解可能是含有两个GA基团的化合物水解的结果，这两个GA基团的水解都导致了原化合物的损失。
图3
4
可水解的单宁不一定能被单宁酶水解
混合绿茶中没食子酰基型化合物占该类化合物总峰面积的16.2%，含量最高的水溶性单宁为1,4,6-tri-O-galloyl-β-D-glucose。混合矢车菊茶中主要含四没食子酰基-葡萄糖，未检出五聚体，并鉴定出多个二没食子酰基-葡萄糖和单没食子酰基-葡萄糖异构体。
三没食子酰基-葡萄糖水解时浓度持续下降，其中天然存在的1,4,6-tri-O-galloyl-β-D-glucose是单宁酶的优良底物。二没食子酰基-葡萄糖水解模式相似，其天然异构体持续下降，而同系物则先积累后完全水解。
作者发现单没食子酰基-葡萄糖的水解模式最复杂：天然异构体D持续下降；异构体A、B、E、F先积累后缓慢下降；异构体C非天然存在但会积累并保持稳定。这表明多没食子酰基-葡萄糖的水解未必定量产生葡萄糖和游离没食子酸，与以往认为鞣酸酶总能将其完全水解的观点不同。实验还显示曲霉鞣酸酶无法水解葡萄糖骨架特定位置的没食子酰基酯。通过标准品比对仅鉴定出异构体D为1-O-没食子酰基-β-D-葡萄糖，针对异构体C的位置需进一步实验确定。
图4
5
非水解没食子酸酯取代在葡萄糖支架上的位置
为精准定位单宁酶无法水解的没食子酰基在葡萄糖骨架上的连接位点，作者研究以五没食子酰葡萄糖、三没食子酰葡萄糖和1-O-没食子酰葡萄糖标准品为对象开展酶解实验，结果显示酶解后大量积累单没食子酰葡萄糖异构体C，而1-O-没食子酰葡萄糖可快速水解，排除C为1位取代异构体。进一步借助700MHzNMR进行结构解析，通过1HNMR、13CNMR结合HSQC、HMBC、NOESY等二维谱数据确认，该异构体C的葡萄糖C6位质子发生高场位移，表明C6位无没食子酰基取代，而H4质子呈现明显低场位移且与没食子酰羰基碳存在关键相关信号，最终确定不可水解的异构体为4-O-没食子酰-β-D-葡萄糖。该结果首次明确无花果曲霉单宁酶对葡萄糖骨架没食子酰基的水解具有严格位置选择性，水解偏好顺序为C1＞C6＞C4，其中C4位酯键无法被水解，打破了单宁酶可完全水解所有没食子酰葡萄糖的传统认知，也解释了酶解后部分可水解单宁持续残留的核心原因，为深入理解单宁酶底物识别机制提供了关键结构依据。
单宁酶催化没食子酰葡萄糖水解时，除发生位置选择性水解外，还伴随显著的异头物生成现象，这是导致酶解产物中单没食子酰葡萄糖异构体数量远超理论值的关键原因。理论上单没食子酰葡萄糖仅有5种位置异构体，但酶解后检测到至少6种异构体峰，无法仅用位置异构解释。已知葡萄糖C1位羟基未取代时可发生变旋现象，在α和β异头体之间快速转化，本研究通过环离子迁移谱（cIMS）直接证实，单宁酶水解C1位没食子酰基后，葡萄糖C1位羟基裸露，可自由发生变旋并建立异头平衡，与游离葡萄糖的变旋行为一致。基于此推导，五没食子酰葡萄糖经酶解可生成最多9种单没食子酰葡萄糖产物，包含5种位置异构体和4种异头物，本研究实际检测到6种，与理论高度吻合。
图5
6
水解模式相似
以HHDP-葡萄糖为骨架的没食子酰化化合物，在单宁酶催化下的水解规律与葡萄糖骨架没食子酰化物高度相似，呈现明显的位置选择性且无法水解双酯键连接的HHDP基团。这类物质占绿茶没食子酰化物总峰面积的6.0%，主要成分为1-O-没食子酰-4,6-HHDP-β-D-葡萄糖，还包含其他4种单没食子酰-HHDP-葡萄糖异构体和1种二没食子酰-HHDP-葡萄糖。酶解结果显示，所有单、二没食子酰-HHDP-葡萄糖的峰面积均持续下降，其中E异构体水解速率极快，t¾仅26min，属于极佳底物，60min内可完全水解，而A、B异构体水解极慢，C、D异构体水解较差，差异显著。进一步追踪发现，HHDP-葡萄糖浓度在酶解前60min持续上升并保持稳定，证明HHDP结构无法被单宁酶水解。上述结果表明，HHDP基团不影响C1位没食子酰基的水解，底物水解速率仍由没食子酰基连接位置决定，与葡萄糖骨架的水解规律完全一致，进一步验证了单宁酶对C1位没食子酰基的优先选择性。
图6
单宁酶不仅可水解黄烷-3-醇、葡萄糖骨架的没食子酸酯，对有机酸骨架尤其是奎宁酸型没食子酰化物同样具有水解能力，但整体水解效率较低且存在位置偏好。有机酸骨架占绿茶没食子酰化物总峰面积的14.7%，主要为没食子酰奎宁酸，其中含量最高的是5-O-没食子酰奎宁酸（茶没食子素），同时还检测到3-O-没食子酰奎宁酸、4-O-没食子酰奎宁酸及两种二没食子酰奎宁酸异构体。酶解结果显示，所有没食子酰奎宁酸的峰面积均缓慢下降，t¾值均属于极差底物等级，其中5-O-没食子酰奎宁酸水解速率快于3位和4位取代异构体，表明在奎宁酸骨架上同样存在位置选择性。此外，没食子酸本身作为骨架形成的没食子酸-没食子酸酯可被快速水解，属于极佳底物，而鞣花酸因分子内C-C键和双酯键结构无法被水解。特异性实验证实，单宁酶仅水解没食子酰酯键，对咖啡酰、香豆酰等非没食子酰酯键无作用，体现出严格的底物专一性。
图7
该文章首次证实无花果曲霉单宁酶具备水解甲基没食子酸酯键的能力，甲基化修饰对酶的水解能力影响较小，且水解规律与普通没食子酰化物保持一致。在混合绿茶中暂定鉴定出3种甲基没食子酰化黄烷-3-醇和1种甲基没食子酰奎宁酸，这类物质仅占没食子酰化物总峰面积的0.1%，含量较低。酶解实验结果显示，甲基没食子酰化黄烷-3-醇的水解效率为中等至极佳，主要受黄烷-3-醇母核影响，与普通没食子酰化黄烷-3-醇的水解偏好一致；而甲基没食子酰奎宁酸水解缓慢，属于极差底物，与普通没食子酰奎宁酸的水解模式相同。该结果突破了以往单宁酶仅水解没食子酸酯的认知，将其底物范围扩展至甲基没食子酸酯，同时表明甲基修饰不会显著改变酯键的水解特性。
图8
单宁酶催化释放没食子酸可显著抑制绿茶自动氧化褐变，但无法实现完全抑制，最优抑褐效果出现在300min，延长处理时间无额外提升。酶解过程中，游离没食子酸浓度从0.8mM快速升至7.3mM，释放率达91.7%，茶汤pH从5.8降至4.6，其中53.9%的没食子酸在30min内快速释放，300min时pH即达到稳定值，酶活实验证实酶持续保持活性，平台期并非酶失活导致。加速氧化实验显示，酶解样品的褐变强度（BCI）和色差（ΔEab）均显著低于对照组，pH与褐变指标高度正相关（R²=0.93、0.88），证明抑褐主要依赖pH降低。但由于pH4.6未达到完全抑褐所需的4.1以下，且40℃长时间孵育会促进残留酚类氧化，导致300–480min褐变略有回升，后续因多酚聚合溶解度下降褐变轻微降低。综合来看，单宁酶可作为清洁标签抑褐手段，但需与其他策略结合才能实现完全抑褐，300min为工业应用最优时长。
文章信息：
https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2025.147775
