影像学检查和肿瘤活组织检查是临床上肿瘤诊断和监测的主要手段，这些检查在治疗前的确非常有效，但是频繁和重复的影像学检查及活检用于术后监测是不切实际的。液体活检（Liquid biopsy）技术是指通过采集和检测人体体液样本实现肿瘤监测的一种技术，虽然尿液、粪便、脑脊液、唾液、腹水等体液都是肿瘤源性物质的潜在来源，但血液仍然是主要的液体活检样本。
相比于传统的肿瘤检测方法，液体活检技术具有取样方式灵活、无创便捷、可以反复多次取样、依从性高等特点，因此可能在肿瘤筛查、疗效检测、用药指导等方面发挥重要作用。
液体活检与HPV病毒
液体活检样本中存在多种携带肿瘤相关信息的物质，包括循环肿瘤细胞、循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）和RNA、肿瘤细胞释放的外泌体等等。其实正常人的血液中，也含有一些片段化的DNA，我们称之为cfDNA，科学家认为这些cfDNA是通过细胞凋亡或者坏死释放到血液中的，进入血液之后，cfDNA会被快速从血液中清除，半衰期不超过1小时，健康人血浆中的正常细胞的cfDNA含量是比较低的。
而ctDNA就是指从肿瘤细胞中释放出来的DNA，与正常的cfDNA在序列特征上有一些差别，因此，通过对血浆中ctDNA进行测序，就可以了解很多肿瘤的相关信息，尤其是对于某些病毒感染引起的肿瘤，其cfDNA中往往含有很多病毒特异性的基因信息。
人乳头瘤病毒（human papillomavirus，HPV）是一种广泛感染人类的病毒，大多数HPV的感染对人体无害，在两年内可以被人体的免疫系统自行清除，但持续的高危型HPV感染可以导致多种癌症的发生，对全人类的健康造成严重威胁。
在美国，每年有1400万人感染HPV病毒，大多数人一生中至少会感染1次HPV病毒，每年与HPV相关疾病（疣、癌前病变、癌）相关的总医疗费用高达80亿美元。2009年，美国估计有34788例新发性与HPV相关癌症，包括宫颈癌、肛门癌、口咽癌和外阴癌等，其中最常见的口咽癌和宫颈癌，这些癌症中很大一部分由HPV16型和18型引起。
图1 HPV 16型病毒粒子结构
在HPV病毒引起的肿瘤中，通过病毒基因组可以区分ctDNA和正常细胞来源的cfDNA，因此，可以对患者血浆中cfDNA进行检测来了解患者的肿瘤负荷情况。
ctDNA可作为HPV引起肿瘤监测指标
一项研究探讨了HPV相关的ctDNA作为口腔鳞癌复发的指标可行性。HPV引起的口腔鳞癌治疗效果远远优于非HPV感染的口腔鳞癌，然而仍然有10%~25%的患者会在治疗后出现疾病复发。CtDNA水平的动态变化与肿瘤的转移或者患者的治疗反应相关。
有研究纳入了115例HPV相关的口腔鳞癌患者，所有患者均接受治疗性放化疗（CRT），患者接受3个月的治疗性放化疗后PET-CT，在之后的1~2年中，每2~4个月进行临床评估，在3~5年期间每6个月进行一次评估。每6~9个月收集一次患者血液样本，使用多重分析数字化PCR分析血浆中的HPV相关ctDNA，所有患者的中位随访时间为23个月。
图2 DOI：10.1200/JCO.19.02444
其中，15名患者出现疾病复发，87例患者在治疗后各个时间点均没有检测到HPV相关ctDNA阳性，这些患者也均未出现复发，28名患者在治疗后监测中出现ctDNA阳性，其中15人复发，而16名患者连续2次血液检测呈现阳性，复发的15名患者均在其中。HPV相关的ctDNA阳性与活检证实复发之间的平均时间为3.9个月。
这项研究证实，基于HPV相关的ctDNA检测用于HPV相关肿瘤复发的监测是可行的，其他一些类似的研究也验证了这一结论。
然而，当下的ctDNA检测多采用定量PCR（qPCR）和数字化PCR（dPCR），存在精度不够的问题，当DNA的拷贝数小于1时，采用这些方法检测会有一些困难，如何提高检测的敏感性，是科学家一直关注的问题。
超高HPV ctDNA检测助力肿瘤液体活检
近日，来自加拿大多伦多的玛嘉烈公主癌症中心的研究人员在Clinical Cancer Research上发表了一篇题为HPV sequencing facilitates ultrasensitive detection of HPV circulating tumor DNA的文章，这项研究提供了一种超敏感的HPV特异性ctDNA的检测方法，HPV-seq大大提高了检测的敏感性，能够在dPCR阴性的治疗后样本中检测到低至0.03 拷贝/ml的ctDNA。
图3 DOI：10.1158/1078-0432.CCR-19-2384
图4 HPV-seq和双链杂交捕获原理
HPV-seq采用了一种双链杂交捕获的方式从序列文库中富集病毒DNA，能够定性和定量地提供HPV相关肿瘤患者ctDNA的信息，不仅具有超高的敏感性，而且能够提供ctDNA的片段长度和HPV基因型信息。每个全长的病毒基因组大约能够产生50种不同的cfDNA片段。
结果显示，HPV-seq 的结果和dPCR具有高度相关性，而且能够检测出dPCR不能检测到的ctDNA，治疗结束后检测到HPV ctDNA与较差的无病生存期相关，其对疾病复发预测的敏感性为100%，特异性为67%。对HPV型别鉴定的准确率达到100%。HPV ctDNA片段的大小始终短于非癌症来源的cfDNA片段，并且在HPV基因组中观察到固定的cfDNA片段组模式。
总之，本研究提出的HPV-seq确实是一种有效的ctDNA定量方法，优于传统的dPCR。
通过这种超高敏感性的检测方法，可以迅速发现患者是否有肿瘤复发的倾向，更早地采取行动，对于提高患者预后具有重要意义。同时，这项技术也可以用于其他由特定病原体引起的癌症的检测和治疗，造福更多肿瘤患者。
作者：殷其雷
来源：临床前线
参考资料：
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