Nature | 突破性发现：CREM揭示CAR-NK细胞“疲惫”之谜，抗癌效力有望飙升！

分类：科学
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引言

嵌合抗原受体（chimeric antigen receptor, car）技术，特别是car-t细胞疗法已在血液肿瘤领域取得了里程碑式的成功，而天然杀伤（natural killer, nk）细胞，作为先天免疫系统的“第一道防线”，其强大的抗肿瘤潜力正被寄予厚望，car-nk细胞疗法也因此成为了肿瘤免疫治疗的“新星”。

然而，正如任何强大的武器都可能遭遇挑战，car-nk细胞在复杂的肿瘤微环境中并非总能所向披靡。它们常常会面临“功能疲惫（dysfunction/exhaustion）”的困境，导致抗癌效果大打折扣。究竟是哪些分子机制在背后操纵着car-nk细胞的“活力开关”呢？尽管目前对tigit、tim3等表面免疫检查点已有了解，但对于那些可能从细胞内部深层调控免疫细胞功能的转录因子（transcription factor），研究仍然有限。
6月4日《nature》的研究报道“crem is a regulatory checkpoint of car and il-15 signalling in nk cells”，在这一未知的领域中取得了突破性进展，揭示了一个关键的“幕后推手”——crem（camp response element modulator）。通过对肿瘤小鼠模型中过继转移的car-nk细胞进行深入的单细胞转录组（single-cell transcriptome）分析，意外地发现，在car-nk细胞发挥效应功能的巅峰期，crem的表达量显著升高。但更令人费解的是，这种升高既与细胞的激活特征（如颗粒酶b（gzmb）、溶细胞素（gnly）等抗肿瘤效应基因的上调）同时出现，也伴随着功能失调的标志（如tigit、klrg1等抑制性检查点基因的升高）。这暗示crem可能是一个双刃剑，既是激活的伴随，也预示着潜在的疲惫。
进一步的机制探索表明，car活化信号和白细胞介素-15（il-15）刺激都能快速诱导crem的上调，并且这种诱导通过pka-creb信号通路介导。此外，当研究人员通过基因编辑敲除car-nk细胞中的crem时，这些细胞在体外和体内都展现出显著增强的抗肿瘤能力，能够更有效地清除肿瘤，增强对肿瘤诱导的免疫抑制的抵抗力，甚至在动物模型中延长了生存期。这一发现不仅为我们深入理解nk细胞功能提供了新的视角，更指明了通过靶向crem来提升car-nk细胞疗效的潜在新策略，为攻克癌症带来了新的希望。
免疫细胞的“疲惫开关”：crem的意外发现
这项研究始于一个大胆的疑问：在car-nk细胞执行抗肿瘤任务时，它们的基因表达发生了怎样的变化？研究人员深入分析了在小鼠肿瘤模型中过继转移后的car19-il-15 nk细胞的单细胞转录组数据（single-cell rna sequencing, scrna-seq）。这些细胞被输注到淋巴瘤小鼠体内，在清除肿瘤的过程中，发现了一个基因的表达量显著升高——那就是crem。
研究发现，在体内输注后，car-nk细胞的crem表达量显著升高，与输注前相比，在第7天和第14天，平均表达量分别增加了约2.5倍和约3倍，且这种升高与小鼠体内肿瘤控制的改善呈正相关。这似乎在暗示crem与car-nk细胞的抗肿瘤活性密切相关。但更深入的分析却揭示了其复杂性：这些crem高表达的car-nk细胞，不仅表现出如颗粒酶b（gzmb）和溶细胞素（gnly）等效应基因的升高，暗示它们正在积极攻击肿瘤，同时也伴随着如tigit、klrg1等抑制性检查点基因的表达上调，这通常与免疫细胞的“疲惫”或功能受损相关。这表明，crem可能参与了car-nk细胞在激活状态下的平衡调控，既有激活的印记，也伴随着功能失调的信号。
为了进一步探究crem在肿瘤免疫中的普遍性，研究人员分析了来自tisch2数据库的肿瘤浸润nk细胞（tumor-infiltrating nk, ti-nk）数据。惊人地发现，在多种癌症类型中，ti-nk细胞的crem表达量普遍高于外周血单核细胞（pbmc）中的nk细胞。特别是在膀胱癌、胆管癌和肺癌中，ti-nk细胞的crem表达量显著增高。更有趣的是，在胰腺癌患者的转移性ti-nk细胞中，crem的表达量达到了最高水平，甚至在差异活跃的转录因子调控网络中排名前50位。这些数据强烈暗示，crem在肿瘤微环境中的高表达可能与nk细胞的功能受损有关，甚至在某些情况下，高crem表达与患者不良预后（如低级别胶质瘤、肺腺癌、胃腺癌和乳腺浸润性癌）相关。这进一步强化了crem作为免疫检查点的潜在角色。
研究人员还利用质谱流式细胞术（mass cytometry, cytof）对nk细胞的表型进行了深入剖析。研究显示，高表达crem的car-nk细胞（特别是car70-il-15 nk细胞）同时伴随着激活标志物（如nkg2d、cd25、cd2、gzmb和perforin）和抑制性标志物（如nkg2a、lag3、tigit和tim3）的更高表达。这一发现进一步佐证了crem的诱导可能与nk细胞的“激活诱导性疲惫（activation-induced exhaustion）”表型密切相关，它在介导抗肿瘤活性的同时，也可能启动了负反馈调节机制。
“点火器”的秘密：car激活与il-15如何诱导crem
既然crem如此重要，那么它究竟是如何被car-nk细胞激活的呢？研究人员深入研究了car活化信号和il-15细胞因子信号对crem表达的影响。
当car-nk细胞与靶抗原（cd70）结合时，crem的表达量在car70 nk细胞中显著升高，与未转导的nk细胞或缺乏胞内信号域的car-nk细胞相比，crem mrna表达量可增加约6倍。这明确指出，car分子内部的itam（immunoreoreceptor tyrosine-based activation motif）信号在crem诱导中扮演了关键角色。
il-15作为car-nk细胞疗法中常用的促增殖和持久性细胞因子，也展示了其对crem的强大诱导能力。il-15能够以剂量依赖的方式（从50 pg/ml到5000 pg/ml）显著增加crem的表达，其诱导强度甚至高于等剂量的il-2。当car激活与il-15刺激同时存在时，crem的表达量呈现出叠加效应，这意味着这两种信号通路可以协同作用来诱导crem。crem mrna的表达在il-15刺激后6小时即可上调，并在24-48小时达到峰值，在96小时内回到基线，显示出其转瞬即逝的诱导特性。而在持续分泌il-15的car-il-15系统中，crem则持续高表达。
除了car和il-15，研究人员还测试了其他常见细胞因子和内源性nk细胞受体对crem表达的影响。结果显示，il-2、il-12和il-18也能剂量依赖性地诱导crem表达，其中il-15的诱导作用最强。此外，通过抗cd16、抗nkp30和抗nkp46抗体激活nk细胞内源性受体，也同样能上调crem表达。这表明，crem的上调是nk细胞活化的一个普遍特征，由细胞因子和itam信号共同驱动，并且其强度和动力学特征因刺激类型而异。
机制揭秘：pka-creb轴的“幕后推手”
既然crem在nk细胞活化中如此重要，那么其信号通路是怎样的呢？研究深入剖析了crem诱导的分子机制，揭示了pka-creb信号轴的关键作用。
camp信号通路在细胞中扮演着重要角色，而crem正是其关键调控因子之一。当细胞内camp水平升高时，蛋白激酶a（pka）会被激活，进而磷酸化转录因子creb和crem。这些磷酸化的转录因子结合到camp反应元件（camp-response elements, cres）上，调控靶基因的转录。研究证实，这一经典的pka-creb轴在car-nk细胞活化中发挥了核心作用。
具体而言，car激活能够导致car70 nk细胞中creb的显著磷酸化（pcreb），但这种磷酸化在未转导或缺乏胞内信号域的car-nk细胞中不明显。这意味着car分子的cd3ζ链信号在诱导pcreb中至关重要。更有力的是，当预处理nk细胞，使用pka抑制剂h89或钙螯合剂egta时，car诱导的creb磷酸化和crem诱导都被强烈抑制了。这与之前t细胞受体（tcr）信号下游pka磷酸化creb的发现不谋而合。
il-15同样能以剂量依赖的方式增加pka活性和pcreb水平，且h89和egta也能有效阻断il-15诱导的creb磷酸化和crem表达。这有力支持了pka-creb轴在car激活和il-15刺激介导的crem上调中扮演的关键角色。
研究人员还通过染色质免疫沉淀（chromatin immunoprecipitation, chip）和定量pcr（qpcr）实验，进一步证实了pcreb能够强烈结合crem启动子（crem promoter 1），其结合强度与crem的转录水平呈正相关。这表明crem很可能是一个直接被creb调控的靶基因。
值得注意的是，il-15还通过jak-stat通路激活nk细胞，特别是stat3和stat5。数据显示，il-15能够剂量依赖性地增加pstat3和pstat5，其中pstat5表现出更高的敏感性。虽然stat3和stat5也参与了crem的诱导（stat3或stat5的缺失部分降低了crem表达），但crem的诱导在car激活后仍能独立于stat信号发生，主要依赖于pka-creb轴。这揭示了car-nk细胞中crem调控的双重机制：通过pka-creb信号轴和il-15下游的stat3-stat5通路。
解除“封印”：crem删除后的car-nk细胞威力大增！
既然crem在nk细胞活化中扮演了复杂的角色，那么，删除crem是否能提升car-nk细胞的抗肿瘤能力呢？研究人员运用crispr-cas9基因编辑技术，在car-nk细胞中特异性敲除了crem。
在体外实验中，crem缺失（crem ko）的car-nk细胞展示出显著增强的细胞毒性。无论是长期的二维培养、三维肿瘤球体（tumor spheroid）培养，还是肿瘤再挑战实验中，crem ko的car-nk细胞都表现出更强的杀伤能力。例如，在针对umrc3细胞的球体杀伤实验中，crem缺失的car70-il-15 nk细胞在第5天时能够将肿瘤球体的平均绿色图像强度降低至对照组的约20%，而野生型细胞仅能降低至约40%，显示出更有效的肿瘤抑制能力。这种增强效应在低效应-靶细胞比率（effector-to-target ratio）下尤为明显，且无论肿瘤细胞是否表达靶抗原cd70，crem的缺失都能提升il-15分泌型nk细胞的效应功能，表明crem作为il-15或car信号下游的一个通用抑制性检查点。
体外效力的提升在体内模型中得到了更有力的验证。在侵袭性cd70阳性raji伯基特淋巴瘤小鼠模型中，与野生型crem car70-il-15 nk细胞、未转导nk细胞或未治疗对照组相比，接受crem ko car70-il-15 nk细胞治疗的小鼠肿瘤控制效果显著增强，并最终改善了小鼠的生存率。具体而言，crem ko组小鼠的肿瘤负担在第14天时仅为野生型组的约20%，生存期显著延长（p值小于0.0001）。此外，crem ko还促进了car-nk细胞在外周血（在第10天和第20天，car+ nk细胞数量分别是野生型组的约2.5倍和约2倍）以及肝脏、肺、骨髓和脾脏中的增殖和浸润。
在转移性cd70阳性乳腺癌pdx模型（patient-derived xenograft, pdx）中，接受crem ko car70-il-15 nk细胞治疗的小鼠，其肺部和肝脏的肿瘤负担显著降低，且car-nk细胞在这些器官中的增殖和浸润也显著增加。在胰腺癌小鼠模型中，腹腔注射crem ko car.trop2-il-15 nk细胞也显著改善了肿瘤控制并延长了细胞的体内持久性。
更重要的是，这些增强的抗肿瘤效果并没有以牺牲安全性为代价。在多个小鼠模型中，crem ko car-nk细胞的治疗耐受性良好，小鼠体重保持稳定，且主要器官的组织学分析未显示明显的毒性或异常。这为crem作为car-nk细胞疗法的潜在治疗靶点提供了坚实的证据。
深度剖析：crem如何重塑car-nk细胞的“命运”？
crem删除为何能带来如此显著的疗效提升？研究人员通过染色质免疫沉淀测序（chip-seq）和转录组测序（rna-seq）深入探究了crem对car-nk细胞的转录和表观遗传重编程机制。
转录重编程：从“疲惫”到“火力全开”
研究发现，crem作为一种转录因子，能够直接结合到基因组上的多个位点。在crem敲除后，car-nk细胞的基因表达发生了显著变化。与野生型crem car70-il-15 nk细胞相比，crem ko导致了：
效应基因的上调：如颗粒酶b（gzmb）和干扰素-γ（ifng）的表达显著升高，这些是nk细胞执行杀伤功能的核心武器。
nk细胞发育转录因子的上调：如klf7和runx2，这些因子与nk细胞的成熟和功能密切相关。
疲惫和应激相关基因的下调：如btg1、dusp2、smad3和rgs1，这些基因通常与免疫细胞的功能受损和应激反应有关。
通过基因集富集分析（gene set enrichment analysis, gsea），发现crem敲除显著上调了对nk细胞效应功能和代谢至关重要的通路，包括myc靶点v1（myc targets v1）、e2f靶点（e2f targets）、mtorc1信号通路（mtorc1 signaling）和氧化磷酸化（oxidative phosphorylation）。同时，它下调了免疫抑制性通路，如缺氧（hypoxia）和tgfβ信号（tgfβ signaling）。这些发现共同指向一个结论：crem通过直接结合并调控基因表达，促进了nk细胞的功能失调和疲惫状态，而crem的缺失则逆转了这一过程，使car-nk细胞能够保持更强的抗肿瘤活性和增殖能力。
表观遗传重编程：解除染色质的“枷锁”
研究人员进一步通过转座酶可及染色质测序（atac-seq）分析了crem对car-nk细胞表观遗传景观的影响。在与肿瘤细胞共培养时，野生型crem car70-il-15 nk细胞的染色质可及性（chromatin accessibility）降低，这表明基因组变得更加“紧密”，不利于基因的表达。然而，crem ko的car70-il-15 nk细胞即使在肿瘤微环境中，也能够维持更加开放的染色质景观。这意味着crem的缺失使得与免疫细胞激活、代谢和效应功能相关的关键基因区域更容易被转录机器接触到，从而促进了这些基因的表达。
具体的分析显示，crem ko的car-nk细胞在与肿瘤细胞共培养时，在多种细胞代谢和效应通路（包括mtorc1、pi3k-akt-mtor信号通路和有丝分裂纺锤体）相关的基因位点上保持了更高的染色质可及性。此外，ap-1复合体（ap-1 complex）成员（如jun相关因子）、stat家族和cebp家族转录因子的结合基序（motif）在crem ko细胞中显著富集，这些转录因子是nk细胞活化和功能的重要调控者，其可及性的增加预示着细胞激活能力的提升。
代谢重编程：更强的“动力引擎”
除了转录和表观遗传的改变，crem的缺失还显著改善了car-nk细胞的代谢健康。通过海马线粒体功能分析（seahorse assays），发现crem ko的car70-il-15 nk细胞展示出增强的糖酵解能力（glycolytic capacity），并有增加线粒体呼吸（mitochondrial respiration）的趋势。这意味着这些细胞拥有了更强的“动力引擎”，能够更有效地产生能量以支持其抗肿瘤功能和持久性。
crem——car-nk疗法的新靶点
这项开创性的研究首次确立了crem作为car-nk细胞活化中的一个关键转录检查点。揭示了car激活和il-15信号通过pka-creb信号轴共同诱导crem，而crem的过度表达则可能导致nk细胞的激活诱导性疲惫。更重要的是，通过基因编辑敲除crem，成功地“解除”了car-nk细胞的“封印”，使其抗肿瘤效力显著增强，且不增加毒性。
这一发现为car-nk细胞免疫疗法开辟了全新的策略。未来的研究还可以着重于：
开发crem特异性抑制剂：直接靶向crem或其信号通路，以期在临床上增强car-nk细胞的抗肿瘤活性。
优化car-nk细胞设计：将crem的敲除或抑制整合到car-nk细胞的制备流程中，以期获得更高效、更持久的抗肿瘤细胞产品。
深入理解crem异构体功能：crem有多种异构体，不同异构体的功能可能存在差异，进一步研究其特异性功能可能带来更精准的调控策略。
car-nk细胞疗法正以惊人的速度发展，成为对抗癌症的强大武器。而crem的发现，如同在迷雾中点亮了一盏明灯，指引我们更深入地理解nk细胞功能调控的复杂机制，并为开发下一代更有效、更安全的car-nk细胞疗法提供了崭新的靶点和无限可能。

参考文献

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