伤口愈合是一个复杂的生物过程，涉及到各种细胞类型之间密切的相互作用。慢性非愈合性伤口，如糖尿病性伤口，表现为愈合失调。它们表现为延长的炎症期，并未能过渡到增殖期，从而诱导持续炎症。此外，糖尿病创面微环境中的细胞表现出促细胞因子和抗炎细胞因子的失调，血管生成受损。具体来说，糖尿病创面内的成纤维细胞表现出不需要的表型和行为，其标志是ECM合成减少、增殖和迁移能力下降。
为了解决这一问题，来自英国诺丁汉大学的Amir M Ghaemmaghami团队通过开发活性生物诱导基质细胞诱导材料来积极调节成纤维细胞的表型和行为，进而促进糖尿病创面愈合。通过对一系列表面化学物质的筛选，作者发现了pTHFuA(促增殖聚合物)，并首次成功地利用表现活性单体修饰微粒，在体内传递具有生物指导性的聚合物。
相关研究成果以“Microparticles decorated with cell-instructive surface chemistries actively promote wound healing”为题于2022年11月28日发表在《Adv. Mater.》上。
- 发现成纤维细胞指导聚合物
对于促进伤口愈合的材料，化学线索必须指导成纤维细胞附着、扩散和增殖，同时控制向肌成纤维细胞的分化。成纤维细胞呈圆形，表明其扩散不足，从而阻碍了细胞功能。成纤维细胞在聚合物上的大小也在5–175%之间(图1a)。为了了解聚合物对成纤维细胞增殖和分化的影响，作者绘制了增殖指数和α-SMA表达(相对于TCP)的倍数变化，这使得相对于TCP控制的聚合物的表型调节能力得以可视化（图1b）。增殖和分化都是决定伤口愈合结果的关键表型性状。α-SMA作为成纤维细胞向肌成纤维细胞分化的标记物，在本研究中被用作成纤维细胞行为的替代物。肌成纤维细胞是参与伤口愈合的关键细胞类型，它的持续存在与疤痕愈合有关。
此外，从高通量筛选中选择pTHFuA和pEGPEA是因为a)它们的变异系数(COV)低，因此重复性高，b)它们可以使用热自由基聚合聚合，c)它们可以合成表面活性剂制备微粒(即去除固有交联的聚合物)。因此，增殖指数或α-SMA表达发生更高倍变化的聚合物表示无法合成表面活性剂，因此无法合成微粒和/或COV较高，降低了重现性。因此，作者将pTHFuA指定为增增殖聚合物，把pEGPEA指定为抗增殖聚合物。
图1 发现调节成纤维细胞表型的聚合物
作者对抗增殖和增殖聚合物表面的伤口闭合进行了划痕试验。48小时后，促增殖表面的成纤维细胞侵蚀了48%的初始“伤口”区域，而抗增殖表面的这一比例为35%(图1d和e)。在96小时时，促增殖表面的伤口闭合率为82%，而抗增殖表面的闭合率为55%。这一观察显示了促增殖聚合物的功能能力，加速成纤维细胞增殖和迁移，带来伤口愈合。
- 微粒的制造与表征
具有促增殖和抗增殖表面化学作用的聚合物微粒被用于在伤口环境中刺激具有生物指导性的基质细胞壁龛。微粒是用液滴微流控工艺制成的，以达到均匀的颗粒大小。作者通过合成THFuA -共聚(乙二醇)甲基醚甲基丙烯酸酯(mPEGMA)和EGPEA-co-mPEGMA聚合物分别作为促增殖和抗增殖的表面活性剂。用于生产微粒的核心材料是1,6己二醇双丙烯酸酯，使微粒不可降解。这种更简单的非可吸收系统可以在体内实验中不存在生物吸附的复杂性的情况下研究表面化学的生物指导潜力。
为了研究表面，使用扫描电子显微镜(SEM)和飞行时间-二次离子质谱(ToF-SIMS)对微粒进行了表征（图2）。不含冲剂的颗粒变化最大，为4.8%，与不存在表面活性剂稳定界面相一致。添加了表面活性剂的微粒的COV为3.4% (THFuA-co-mPEGMA)和3.0% (EGPEA-co-mPEGMA)，表明与不添加表面活性剂的微粒相比，表面活性剂能有效稳定微粒表面。
图2 微粒的制造与表征
- 生物指导性微粒促进创面愈合成纤维细胞表型
接着，通过测定细胞总DNA含量来研究成纤维细胞在被膜微粒上的粘附和活性。研究显示，促增殖和抗增殖微粒都支持较高的细胞活力。通过测量培养24-96小时内细胞数量的增加来研究成纤维细胞的增殖(图3a)。与抗增殖微粒相比，促增殖微粒附着成纤维细胞的数量增加了约3倍(增加1.5倍)。为了进一步表征成纤维细胞的功能反应，用qPCR方法研究了促增殖和抗增殖微粒培养的细胞中ECM标记ⅰ型胶原(α1)和ⅲ型胶原(α1)的基因表达。这是由于成纤维细胞是参与这两种标记物表达的主要细胞类型。在抗增殖微粒上培养的成纤维细胞，I型胶原蛋白和III型胶原蛋白均上调，基因表达分别上调了7.1倍和13.5倍(图3c)。
图3 致伤微粒上成纤维细胞的功能行为和表型
- 促增殖和抗增殖微粒在体内影响糖尿病创面愈合
将糖尿病小鼠侧侧全层切除皮肤伤口在接受促增殖和抗增殖功能化颗粒治疗后的愈合情况与未接受治疗的伤口进行比较(图4a)。虽然所有的创面面积都随着时间的推移而减小，但应用增殖微粒以更快的速度减小创面面积(图4d)。与促增殖微粒分布相反，H&E染色(图4b)揭示了伤口空洞内的抗增殖微粒是如何消散到伤口两侧的，在那里可以看到肉芽组织，创面床的中心部分几乎没有肉芽组织深度(GTD)和免疫细胞浸润(图4d和e)。Masson染色(图4c)和随后的胶原蛋白厚度分析(图4e)显示，与抗增殖颗粒和未处理的伤口相比，在糖尿病伤口中添加促增殖微粒导致胶原蛋白生成增加，改善愈合和再生。
图4 从暴露于抗增殖(pEGPEA)和促增殖(pTHFuA)微粒的糖尿病小鼠全层伤口中提取组织学结果
此外，细胞增殖免疫染色显示，与抗增殖创面(p<0.0001)和未处理创面(p<0.0001)相比，增增殖微粒处理的创面有更多的BrdU阳性细胞(图4h)， I型胶原蛋白表达更高(图5a)。所有伤口的胶原蛋白III水平相似(图5b)，这表明促增殖颗粒处理的创面内形成的肉芽组织主要由I型胶原蛋白和III型胶原蛋白组成，从而上调了I/III型胶原蛋白的比例，这与促进小鼠糖尿病创面愈合有关。
图5 用抗增殖(pEGPEA)和促增殖(pTHFuA)微粒处理的糖尿病小鼠切除组织的免疫荧光染色
综上，利用活性生物指导微粒引导成纤维细胞功能表型的策略是利用这些细胞的重构潜力的一种新方法，它具有明显的促增殖和抗增殖表型和行为。通过对一系列表面化学物质的筛选，作者发现了pTHFuA(促增殖聚合物)，并首次成功地利用表面活性方法修饰微粒，在体内传递具有生物指导性的聚合物。与pEGPEA(抗增殖聚合物)包被微粒和未处理的伤口相比，促增殖微粒显著促进伤口愈合和组织肉芽化。这项研究结果为活性非洗脱免疫诱导聚合物(pTHFuA)的适用性提供了新的见解，pTHFuA支持糖尿病伤口愈合，并有可能转化为临床治疗糖尿病伤口、潜在烧伤和其他类型的慢性或急性伤口。
文章来源：https://doi.org/10.1002/adma.202208364
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