Nature Biotechnology | 小身材，大作為：研究人員如何「煉」出超強迷你基因編輯器NovaIscB？

分類：科學
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引言

如果我們可以精確地改寫生命的藍圖，糾正那些導致遺傳疾病的微小錯誤，或者巧妙地調控基因的表達，讓細胞按照我們的意願行事。這不是遙遠的幻想，而是基因編輯技術正在開啟的未來。長期以來，crispr-cas9系統一直是這場革命中最閃耀的明星，它像一把精確的分子剪刀，為研究人員提供了前所未有的力量。然而，就像任何強大的工具一樣，cas9在真正應用於人體治療時也面臨挑戰——它的「體型」相對較大，這限制了通過常見的病毒載體（如腺相關病毒，aav）進行高效安全的全身遞送。更關鍵的是，要在廣闊複雜的基因組中做到真正的「指哪打哪」，同時保持高效率和極低脫靶，仍然是需要不斷攻克的難題。

於是，研究人員的目光投向了自然界的寶庫。在演化的漫長歷史中，生命孕育了無數巧妙的分子機器。omega系統中的iscb蛋白，作為cas9演化上的遠親，以其顯著「迷你」的身材（約是spcas9的三分之一）引起了研究人員的興趣。這種緊湊性是aav遞送的天然優勢。但早期的研究也發現，iscb系統似乎有著「小身材」的煩惱：它的引導rna有效長度較短，這可能導致特異性不如人意，讓它更容易結合到與目標序列有少量錯配的非靶點上。如何在微小的iscb骨架上，同時實現媲美甚至超越cas9的強大活性和精準特異性？這是將iscb從實驗室的發現推向臨床應用必須解決的關鍵問題。
5月7日《nature biotechnology》的研究報道「evolution-guided protein design of iscb for persistent epigenome editing in vivo」，正是迎接這一挑戰的探索之旅。研究人員沒有止步於簡單的篩選，而是結合了自然多樣性的海選、基於蛋白質結構的理性設計以及前沿的深度學習輔助預測，對iscb進行了前所未有的深度改造。通過一系列巧妙的「工程手術」，包括借鑒cas9智慧的結構域嫁接和精細環路重塑，以及對引導rna的優化，最終創造出一個全新的、既緊湊又高效且高度特異的iscb變體。更令人興奮的是，利用這個微型新星，構建一個同樣緊湊的可編程表觀基因組編輯器，並首次證明它可以通過單一aav載體在小鼠體內實現長達數月的持久基因沉默。
海選千里：在自然寶庫中尋找更好的起點
為了找到一個更好的出發點，研究人員進行了一場針對iscb直系同源蛋白（orthologs）的大規模「海選」。他們首先篩選並測試了144種iscb蛋白和6種與iscb演化關係較近的ii-d型cas9蛋白在體外的活性，並確定了它們的靶點相鄰基序（tam）偏好。在這個初步階段，發現除了之前報道的ogeuiscb，還有tbaiscb和兩種ii-d型cas9蛋白表現出體外活性。這些蛋白的一個共同特點是，它們的橋接螺旋（bridge helix, bh）和ruvc-ii區域之間插入了rec結構域，類似於ogeuiscb中的β摺疊rec連接體。
這促使其進行了第二輪更有針對性的搜索，重點尋找包含這類rec插入結構域的iscb蛋白。他們又篩選了240種iscb蛋白，並在體外和人類細胞中進行了測試。最終，共鑒定出了10種在人類細胞中表現出基因編輯潛力的iscb蛋白以及2種ii-d型cas9蛋白。
在這批「候選人」中，orufiscb（492個氨基酸）脫穎而出。通過對20個不同靶點進行測試，orufiscb在人類細胞中表現出最高的插入-刪除（indel）效率，在14個位點檢測到了indel，效率範圍在0.2%到8%之間。這比之前報道的ogeuiscb系統的活性提高了5到10倍。orufiscb主要識別ntaaa tam，但也能識別非規範的ataaa tam。
研究人員進一步探究了orufiscb的「有效引導長度」（effective guide length），也就是為了實現切割活性所需的最小引導-靶標匹配鹼基數。結果顯示，orufiscb在使用14-15 nt引導rna時效率最佳，使用短至13 nt的引導rna也能檢測到活性。相比之下，spcas9通常需要18-20 nt的引導rna，且在使用短於16 nt的引導rna時幾乎沒有活性。iscb相對較短的有效引導長度（14-15 nt vs spcas9 18-20 nt）可能是其特異性較低的一個原因，因為完美匹配的短引導序列在人類基因組中有更多的潛在非靶點。因此，提高iscb的有效引導長度是增強特異性的關鍵。
智慧嫁接：為「小身體」植入「大智慧」——引入rec結構域
基於orufiscb，研究人員開始了蛋白質工程的征程，目標是同時提升活性和有效引導長度。其核心想法是借鑒cas9系統通過其rec結構域與引導rna:靶標dna異源雙鏈體互作的方式，在orufiscb中插入或工程化類似rec的結構域，以增強其對延伸異源雙鏈區域的識別和穩定性，從而增加有效引導長度並提高錯配檢測能力。
通過alphafold2對多種iscb和cas9蛋白結構進行建模，研究人員發現cas9的rec結構域是一個廣泛的插入區域，可以與rna:dna異源雙鏈體的tam遠端區域相互作用。研究人員推測，將rec結構域插入orufiscb的合適位置，可以增加蛋白質與引導-靶標異源雙鏈體接觸的表面積，從而可能提高有效引導長度。
研究人員在orufiscb骨架中選擇了rec結構域的插入位點，並構建了14個orufiscb-rec嵌合體。在體外dna切割實驗中，其中12個嵌合體保留了dna切割活性。進一步在人類細胞中測試發現，來自ii-d型cas9蛋白（如nba-1）和czcbiscb的rec結構域嵌合體表現出顯著活性。特別是包含nba-1 rec結構域的嵌合體，稱之為orufiscb-rec，在人類細胞中的活性平均提高了高達20倍。
然而，初步的點突變測試顯示，簡單的點突變可能會影響蛋白與dna的整體結合親和力，而不能顯著區分靶點和非靶點結合。需要一種更精妙的方法來提高特異性。
精雕細琢：重塑rec區域，平衡活性與特異性
為了創造一個更高特異性的novaiscb變體，研究人員在第三步工程化中著重優化orufiscb-rec。其策略是修改蛋白質柔性區域中的多個殘基，特別是通過交換nba-1 rec結構域中的突出環（extruding loops），希望藉此引入新的上位效應（epistatic effects），使系統能夠優先結合靶點dna而非非靶點dna。研究人員利用了自然界中rec結構域的多樣性，從其他rec結構域中提取了不同的環序列進行交換。
他們構建了52個單一環交換變體，並在人類細胞中測試了它們在使用20 nt和14 nt引導rna時的活性。發現其中一個交換變體（swap 49）在不降低活性的情況下，顯著提高了使用20 nt和14 nt引導rna時的indel活性比率，表明它可能比orufiscb-rec更具特異性。swap 49源自nbacas9-2蛋白。
為了理解swap 49提高特異性的機制，研究人員解析了orufiscb-rec-swap 49的低溫電子顯微鏡（cryo-em）結構，解析度達到了2.72 Å。結構顯示，插入的rec結構域向引導-靶標異源雙鏈體的tam遠端延伸，穩定了更長的異源雙鏈區域。特別是，結構中可以看到引導-靶標異源雙鏈體被解析到20 bp，而之前ogeuiscb的結構只解析到14 bp。這印證了增加有效引導長度的設想。此外，結構還揭示了iscb的催化切割機制：hnh結構域通過一個三方組氨酸簇協調一個鎂離子進行切割，ruvc結構域協調兩個鎂離子。這些結構細節為進一步工程化提供了重要線索。
研究人員將表現最佳的單一環交換變體組合起來，構建了54個雙環交換組合。在人類細胞中測試這些組合發現，某些雙環交換組合在保持與orufiscb-rec相似的靶點活性的同時，顯著降低了使用14 nt引導rna時的活性，使得使用20 nt和14 nt引導rna時的活性差異高達200倍。其中，組合12表現最佳，它包含來自nbacas9-2 rec區域3的swap 49以及來自其他宏基因組來源的ii-d型cas9的rec區域2中的一個環。他們將組合12稱之為novaiscb。
體外實驗顯示，novaiscb的有效引導長度增加到15-16 nt。在人類細胞中，novaiscb在使用19-20 nt引導rna時活性最佳，且相比orufiscb-rec，它在使用短於17 nt的引導rna時活性顯著降低，進一步提高了特異性。
研究人員將novaiscb與野生型orufiscb和orufiscb-rec在更多靶點上進行了比較。結果顯示，novaiscb的indel活性高達約40%，相比之前報道的ogeuiscb活性提高了約100倍。在使用20 nt引導rna時，novaiscb在人類細胞中表現出的脫靶切割特異性與spcas9和ascas12f-yham相當。使用tagmentation-based tag insertion site sequencing (ttiss) 方法，發現novaiscb的脫靶ttiss讀數平均為14.3%，而spcas9為10.2%，ascas12f為10.6%。更重要的是，novaiscb的特異性顯著高於早期工程化版本的ogeuiscb和eiscb，這兩種蛋白的脫靶ttiss讀數均高達77.6%。這表明novaiscb在實現高活性的同時，成功維持了高特異性。
「隱身衣」減負：優化ωrna，讓遞送更輕鬆
蛋白質工程之外，研究人員還對orufiscb系統的引導rna（ωrna）進行了結構引導的優化。其目標是減小ωrna的尺寸，同時可能通過提高穩定性來增加其表達水平，從而優化系統在有限載貨容量（如aav）和低表達環境下的遞送效率。基於orufiscb ωrna的低溫電鏡結構，研究人員鎖定了其非結構化的3'末端和5'引導適配器髮夾結構進行改造。
他們逐步截短了ωrna的3'末端，發現在體外和人類細胞中，即使截短了高達21 nt，切割活性仍能維持或略有改善。同時，從5'引導適配器髮夾的頂部開始逐步截短，發現在與之前驗證高活性的orufiscb-krk蛋白結合時，可以去除42 nt（a12-a57區域），而活性沒有明顯損失。
研究人員將42 nt（5'）和17 nt（3'）的截短（總共移除了59 nt）結合起來，得到了一個更短的166 nt ωrna骨架。當與novaiscb蛋白結合時，這個縮短的ωrna在所有測試的靶點上都表現出強大的活性。此外，這個縮短的ωrna在人類細胞中的表達水平比野生型ωrna骨架提高了大約4倍。總體而言，通過移除多個次級結構，成功減小了ωrna的尺寸，並提高了其表達水平。
一專多能：novaiscb的基因編輯「十八般武藝」
novaiscb的出色表現使其不僅僅局限於產生indel。研究人員進一步探索了它作為通用基因組操作工具的潛力。通過將其核酸酶活性失活（dnovaiscb，d61a/h347a雙突變），並與dna甲基轉移酶（dnmt3a-3l）和轉錄抑制結構域（krab）融合，構建了一個可編程的轉錄抑制系統，稱之為omegaoff。這種融合結構（n端dnmt3a-3l，c端krab）與基於cas9的crisproff系統結構類似。
在人類和鼠類細胞中測試發現，omegaoff能夠有效抑制多種靶基因的表達，包括臨床相關的pcsk9和ttr基因。其抑制水平與基於cas9的crisproff系統相當。通過rna作為omegaoff組分的遞送，研究人員也在靶向ascl1和fabp4時實現了強力抑制，最佳抑制效果出現在ωrna與mrna質量比為2:1時。
更重要的是，在靶向fabp4啟動子區域進行亞硫酸氫鹽測序（bisulfite sequencing）發現，與非靶向ωrna相比，靶向性ωrna在fabp4啟動子區域的cpg位點甲基化水平升高。這表明觀察到的轉錄抑制是omegaoff介導的甲基化所致。通過瞬時轉染實驗，omegaoff的抑制效果可以持續長達21天，這提示改變的甲基化模式可能帶來持久的抑制，即使omegaoff表達消失後。
除了抑制，研究人員也將失活的dnovaiscb與vp64, p65和rta（vpr）轉錄激活結構域融合，構建了omegaon系統，用於基因上調。這個系統也能夠顯著提高靶基因表達，水平與基於dcas9的crispron系統相似。這些結果共同表明，novaiscb-krk具有介導多種基因組操作模式的靈活性，並且由於其與cas9系統在機制上的相似性，可以利用為cas9優化的系統進行直接的構建設計。
深入體內：aav遞送omegaoff，實現持久基因沉默
將novaiscb的緊湊尺寸（614 aa）和優化後的ωrna變體（166 nt）結合起來，意味著可以將融合蛋白和ωrna表達盒打包到一個單一的aav載體中，這為體內遞送提供了極大的便利。研究人員利用肝臟嗜性的aav血清型8，將攜帶omegaoff（基於dnovaiscb）以及靶向小鼠pcsk9啟動子的ωrna的載體注射到小鼠體內。pcsk9基因與膽固醇調節密切相關，是潛在的治療靶點。
注射劑量為每隻動物2×10^11總病毒顆粒。以靶向rosa26基因的引導rna作為陰性對照。在注射後採集血液樣本，測量血清pcsk9蛋白和總膽固醇水平。
結果令人振奮：從注射後第3周開始，接受pcsk9靶向引導rna的小鼠血清pcsk9水平顯著下降。這種下降持續了長達6個月的觀察期。類似地，從注射後第4周開始，血清總膽固醇水平也出現了顯著下降，並持續了整個研究期間，其降低幅度與臨床上使用的pcsk9單克隆抗體所達到的治療效果範圍相似。
為了評估omegaoff的毒性，研究人員在6個月時間點測量了血清總膽紅素（bilirubin）和丙氨酸轉氨酶（alt）水平，這是肝臟功能的重要指標。結果顯示，pcsk9靶向組與未注射組、pbs處理組以及rosa26靶向對照組相比，這些指標沒有發生顯著變化，提示在該劑量下，omegaoff系統在體內具有較好的安全性。
此外，在人類細胞中的rna測序分析也顯示，omegaoff能夠以高度特異性的方式抑制靶基因，與crisproff系統表現一致。這些體內外實驗結果共同展示了利用omegaoff實現持久基因抑制和表觀基因組編輯的巨大潛力。
未來：微型基因編輯工具的新篇章
總而言之，這項研究成功地結合了演化指導和結構引導的工程策略，從自然界中找到並改造了一個緊湊（614個氨基酸）的iscb蛋白——novaiscb，並將其應用於構建緊湊的表觀基因組編輯器omegaoff。
從活性最高的天然直系同源蛋白orufiscb出發，通過插入並工程化來自相關蛋白（包括其他iscb和cas9）的rec結構域，成功地增加了novaiscb的有效引導長度，使其最優使用20 nt引導rna。與野生型orufiscb相比，novaiscb實現了高達約40%的indel活性（提高了約100倍）。更重要的是，通過精心的rec環工程和ωrna優化，novaiscb在保持高活性的同時，其脫靶特異性也達到了與spcas9和ascas12f-yham等成熟系統相媲美的水平，顯著優於早期的工程化ogeuiscb或eiscb。
novaiscb的緊湊尺寸（614 aa）和優化後的ωrna（166 nt）使其能夠被打包到單一的aav載體中，極大地促進了體內遞送。研究人員展示了基於dnovaiscb的omegaoff系統在小鼠體內通過aav遞送，能夠實現長達數月的持久基因抑制，並伴隨表觀遺傳修飾。這不僅為體表觀基因組編輯提供了新的高效工具，也為未來開發更緊湊、更安全的基因治療方法奠定了基礎。
當然，novaiscb目前主要識別ntaaa tam，這雖然能夠靶向90%的人類基因進行敲除和93%的基因啟動子區域進行轉錄調控，但未來擴展其tam兼容性或提高對非規範tam的靶向效率將使其應用更加廣泛。同時，評估novaiscb以及其他基於iscb的基因編輯工具在體內的免疫原性，是將其推向臨床應用的關鍵下一步。
這項研究成功地將自然多樣性篩選、結構生物學、蛋白質工程和深度學習預測相結合，創建了一個性能顯著提升的iscb變體。這一策略不僅為優化基因編輯工具提供了範例，也為通過工程化改造天然酶類，用於分子生物學應用開闢了新的可能性。novaiscb作為基因編輯工具箱中的新成員，有望在疾病研究、基因治療等領域發揮重要作用，解鎖更多生命科學的奧秘。

參考文獻

kannan, s., altae-tran, h., zhu, s. et al. evolution-guided protein design of iscb for persistent epigenome editing in vivo. nat biotechnol (2025). https://doi.org/10.1038/s41587-025-02655-3

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