Nature Methods | 里程碑！ReLiC開創RNA功能研究新紀元

2025年06月06日17:00:15 科學 9721

引言

dna是生命的藍圖，承載著所有遺傳信息。但真正讓生命「活」起來、執行指令的，是dna轉錄出來的rna。然而，這些rna分子並非一勞永逸，它們從誕生到消亡，會在細胞內上演一場場精密的「分子舞步」：剪接 (splicing) 決定基因的最終面貌，翻譯 (translation) 將遺傳信息轉化為功能蛋白，而降解 (decay) 則確保了分子的更新與平衡。這場複雜舞蹈的「編舞者」，正是數千種被稱為rna相關蛋白 (rna-associated proteins, rbps) 的「幕後英雄」。一旦這些精妙的調控環節出現哪怕一絲失衡，就可能導致癌症、神經退行性疾病等多種嚴重的人類疾病。

長期以來，研究人員對這些rna「隱秘舞步」背後的調控網路知之甚少。傳統的基因篩選方法，往往只能通過間接的細胞表型（如細胞生長或熒光信號）來窺探，不僅耗時耗力，還難以直接揭示哪些基因精準調控了rna的特定代謝事件。這就像我們只能看到舞蹈的最終效果，卻無法看清每個舞者的精確動作和他們之間的互動，更別提幕後指揮家的意圖了。

5月29日《nature methods》的研究報道「decoding post-transcriptional regulatory networks by rna-linked crispr screening in human cells」，帶來了一項革命性的突破——relic（rna-linked crispr）篩選平台！這項前沿技術巧妙地將crispr基因編輯的強大精準性與條形碼rna讀數的巧妙結合，就像為細胞內的rna世界安裝了一個「分子偵探」，能夠以前所未有的深度和廣度，大規模解碼每個基因敲除後，數千種rna代謝過程的精微響應。它不僅揭示了生命藍圖的「幕後英雄們」如何協同工作，更打開了探索細胞功能、疾病發生髮展新機制的全新視角。

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革命性工具：relic閃亮登場，破解rna調控難題！

relic (rna-linked crispr) 這項技術巧妙地將crispr基因編輯的精準性與條形碼rna讀數的靈活性相結合，實現了對人類細胞中2,092個已知rna相關蛋白基因敲除後，各種rna代謝過程響應的量化測量。

relic的核心創新在哪裡？想像一下，relic就像一個精密的「分子偵探工具包」，它採用了一種迭代整合策略：

首先，在一個明確的基因組位點，穩定整合編碼cas9酶（crispr基因編輯的關鍵酶）的基因。

接著，再整合一系列攜帶著特定條形碼 (barcoded reporter libraries) 的單嚮導rna (single-guide rnas, sgrnas) 報告庫。這些條形碼會與特定的sgrna以及rna報告分子牢固地「綁定」。

這種創新的位點特異性整合策略 (site-specific integration strategy) 避免了傳統慢病毒遞送 (lentiviral delivery) 中可能出現的sgrna與條形碼鏈接混亂，以及rna條形碼錶達不穩定的問題，確保了實驗的準確性和可重複性。

在初步驗證中，研究人員發現，relic在hek293t和u2os細胞系中能夠均勻表達熒光報告基因，並在cas9酶的介導下有效敲除目標基因。構建的最終文庫針對2,190個基因（包括非靶向對照和必需基因靶向對照），每個基因平均有四個sgrna對。通過對克隆的質粒文庫進行深度測序，他們成功地將n20條形碼與sgrna進行了關聯。數據顯示，超過99%的sgrna和100%的基因都至少有一個可檢測到的條形碼，平均每個sgrna對有8個條形碼，這充分保證了文庫的複雜性和覆蓋度。

此外，relic能夠準確捕捉基因擾動對細胞適應性 (fitness effect) 的影響。研究發現，在cas9誘導後的第13天和第21天，與已知必需基因 (essential genes，共745個) 相關的條形碼在基因組dna和mrna中的丰度均顯著降低。在第13天，條形碼在mrna中的丰度變化與基因組dna中的變化相關性高達0.89，到第21天更是達到0.90，這表明relic不僅技術重複性高，還能有效反映基因敲除對細胞整體狀態的影響。

解密翻譯的奧秘：核糖體佔有率之舞

翻譯是生命從基因到蛋白的「臨門一腳」。relic首次將crispr篩選與核糖體分級技術 (polysome fractionation) 相結合，根據mrna上的核糖體 (ribosome) 數量來測量其翻譯效率，這在現有crispr篩選方法中是無法直接實現的。

研究人員使用了一個β-珠蛋白 (β-globin) 報告基因，它是一種翻譯效率很高的mrna模型。實驗結果顯示，在未受擾動的細胞中，超過75%的β-珠蛋白mrna存在於重多核糖體 (heavy polysome) 部分，這代表它們正在高效地被翻譯。

通過分析數千個基因敲除對核糖體佔有率的影響，研究團隊取得了驚人發現：

翻譯的核心引擎：毫不意外，敲除細胞質核糖體蛋白 (cytoplasmic ribosomal proteins) 和核糖體生物合成因子 (ribosome biogenesis factors) 會導致重多核糖體/單核糖體比率大幅下降。這就像拆掉了生產線上的關鍵部件，生產自然停滯。研究還發現，敲除大型核糖體蛋白和生物合成因子，對mrna在核糖體上結合的影響更大。

翻譯啟動的關鍵：多數翻譯起始因子 (translation initiation factors, eifs) 的敲除也會降低核糖體佔有率，儘管其影響通常小於核糖體蛋白的敲除。例如，eif3複合體的七個亞基（a-e、g和i）被確定為關鍵調控因子，它們的缺失顯著降低了核糖體佔有率。

意想不到的「幕後操手」：除了核心翻譯機器，研究還發現了一些非經典翻譯調控因子。比如，與mrna降解和腺苷酸化調控有關的ccr4-not複合體 (cnot1、cnot2、cnot3和cnot7) 亞基的敲除，也顯著降低了核糖體佔有率。更令人驚訝的是，敲除蛋白酶體 (proteasome) 和tric伴侶蛋白 (chaperonin) 亞基也導致核糖體佔有率顯著下降，其幅度可與核心翻譯起始因子敲除相媲美。這表明，細胞內的蛋白穩態 (proteostasis) 與翻譯過程存在著緊密的互調控關係。

那麼，哪些基因敲除反而增加了核糖體佔有率呢？研究發現，eef2、eif5a和eef1a1的敲除會提高核糖體佔有率，這與它們在促進翻譯延伸 (translation elongation) 中的作用一致。有趣的是，作為核糖體關聯質量控制因子 (ribosome-associated quality control factor) 的ascc3成為重多核糖體/單核糖體比率增加的最高命中基因（log2(h/m) = 0.62）。ascc3負責解離停滯的核糖體，這暗示即使是高效翻譯的mrna，也可能存在一定程度的核糖體停滯和質量控制需求。核糖體碰撞感測器 znf598 和新生多肽n端甲硫氨酸去除酶 metap2 的敲除也增加了核糖體佔有率，這進一步揭示了新生肽處理對mrna翻譯動力學的影響。

剪接的藝術：sf3b家族的精妙調控

rna剪接是真核生物基因表達的另一個核心過程，它負責從前體mrna中移除內含子 (introns) 並連接外顯子 (exons)，以產生成熟的mrna。relic的獨特之處在於，它能直接測量同一條形碼攜帶的不同剪接異構體 (splice isoforms) 的比例，從而精準捕捉基因擾動對剪接的影響。

研究團隊再次利用β-珠蛋白報告基因，這次關注了三種不同的剪接異構體：內含子1滯留 (intron 1 retention)、內含子2滯留 (intron 2 retention) 和外顯子2跳躍 (exon 2 skipping)。結果顯示，隨著cas9誘導時間的延長，識別到的基因命中數逐漸增加。

篩選結果揭示了剪接過程的複雜網路：

核心剪接體 (spliceosome) 組件：大量基因命中集中在核心剪接體組件和剪接相關因子上，它們分布在剪接周期的各個階段。例如，cdk11b和rna聚合酶iii亞基brf2等被識別為剪接功能的反式調控因子 (trans regulators)。

內含子滯留的調控：內含子1滯留的增加與mrna翻譯和核rna外切體 (nuclear rna exosome) 因子有關。這可能通過影響無義介導的mrna降解 (nonsense-mediated decay, nmd) 來起作用。研究發現，外顯子連接複合體 (exon-junction complex, ejc) 成分（如magoh、eif4a3、rbm8a）和rna輸出因子（如ncbp1、ncbp2）僅在內含子1滯留篩選中被識別為命中基因，這與nmd的已知觸發機制相符。

sf3b複合體：剪接的「藝術家」： sf3b複合體是u2小核糖核蛋白 (u2 snrnp) 的關鍵組成部分，在剪接位點選擇中發揮重要作用。令人驚嘆的是，sf3b複合體的不同亞基（sf3b1-7）對剪接事件有著截然不同的影響，儘管它們對於細胞生長都是必需的。例如：

外顯子2跳躍： sf3b1、sf3b2、sf3b3和sf3b5的缺失會導致外顯子2跳躍顯著增加，而sf3b7（phf5a）的缺失僅輕微增加，sf3b4和sf3b6的缺失則沒有影響。

內含子滯留： sf3b6和sf3b7的缺失增加了內含子2滯留，而sf3b1、sf3b2和sf3b5的缺失增加了內含子1滯留。

這些結果提示，sf3b複合體的不同亞基在調控特定剪接事件（如外顯子跳躍或內含子滯留）方面可能存在功能上的分工。通過對內源性mrna進行rna測序 (rna-seq) 驗證，研究發現，sf3b5的缺失導致45個注釋的盒式外顯子 (cassette exon) 發生10%或更高的跳躍，而sf3b6或aqr的影響則小於10個外顯子。這項工作不僅揭示了sf3b家族對剪接的精妙調控，也為理解其在疾病中的作用提供了新的視角。

守衛mrna質量：nmd巡邏隊的高效運作

細胞內部有一支名為nmd (nonsense-mediated mrna decay) 的「巡邏隊」，專門負責識別和降解含有提前終止密碼子 (premature termination codon, ptc) 的異常mrna，以防止其翻譯出有毒的截短蛋白。relic能夠精確測量基因敲除對ptc報告基因mrna水平的影響，從而識別nmd途徑的關鍵調控因子。

研究人員構建了一個在第二個外顯子位置引入ptc的β-珠蛋白報告基因。在穩態條件下，這個含有ptc的報告基因mrna水平相比正常終止密碼子 (normal termination codon, ntc) 的報告基因顯著降低，這證實了nmd的有效性。通過relic篩選，研究識別出90個基因敲除會增加ptc報告基因的mrna水平，這其中就包括了nmd途徑的核心組分，如upf1、upf2、smg1、smg5和smg7。這再次證明了relic在識別特定rna質量控制因子方面的強大能力。

令人驚喜的是，除了nmd核心因子，篩選還發現一些參與內質網 (endoplasmic reticulum, er) 和線粒體 (mitochondrial homeostasis) 穩態的基因（如hspa5、hspa9和phb1）的敲除也會增加ptc報告基因的水平。這與先前的研究一致，即內質網和線粒體穩態的擾動會導致eif2a磷酸化，從而抑制nmd。

為了進一步深入探究，研究團隊還利用relic進行了化學修飾劑篩選 (chemical modifier screen) 和遺傳修飾劑篩選 (genetic modifier screen)。

在化學修飾劑篩選中，他們使用isrib（一種能使翻譯對eif2a磷酸化不敏感的小分子）處理細胞。結果發現，30個基因敲除會降低ptc報告基因的mrna水平，其中就包括了內質網/線粒體蛋白和氨醯trna合成酶 (aminoacyl-trna synthetases)。

在遺傳修飾劑篩選中，他們敲低了eif2a激酶gcn2（當氨醯trna合成酶受抑制導致未充電trna積累時，gcn2會被激活）。結果顯示，在降低gcn2表達後，12個基因敲除（其中10個是氨醯trna合成酶）導致ptc報告基因水平降低。

這些精密的組合篩選策略，就像剝洋蔥一樣，層層揭示了基因產物調控rna過程的分子途徑，為我們理解細胞如何維護mrna質量提供了前所未有的細節。

藥物的幕後舞者：hht與gcn1的意外邂逅

最後，relic被應用於一個實際的生物醫學問題：揭示細胞對高三尖杉酯鹼 (homoharringtonine, hht) 這種抗白血病藥物的響應機制。hht是一種靶向核糖體的化療藥物，通過抑制蛋白合成來治療慢性髓性白血病。然而，細胞如何響應這種翻譯抑制，仍有待深入理解。

研究人員使用增強型黃色熒光蛋白 (eyfp) 作為報告基因，並用hht處理細胞。relic篩選結果令人矚目——gcn1，一個在正常篩選中並非顯著命中的基因，成為唯一的顯著命中基因（fdr < 0.05）。gcn1的敲除會顯著增加eyfp mrna的水平。

gcn1作為核糖體碰撞感測器 (ribosome collision sensor)，通常在氨基酸受限時激活激酶gcn2，從而引發eif2a磷酸化。研究發現，hht處理後，在gcn1缺失的細胞中，p38的磷酸化水平增加，而這種增加是依賴於zak激酶的。進一步的rna測序分析顯示，hht處理在gcn1缺失的細胞中導致了60個基因（包括fos、jun和myc等即時早期基因 (immediate early genes, iegs)）的差異上調。這些發現被進一步驗證，並發現zak或gcn2的藥理學抑制可以阻止gcn1缺失細胞中ieg的上調。

這些數據強有力地表明，gcn1在hht治療引起的核糖體碰撞應激中扮演著關鍵的緩解角色。它像一個「警報器」，感知核糖體碰撞，並觸發下游信號通路來應對這種應激。

relic的廣闊天地

relic技術不僅成功揭示了rna翻譯、剪接和降解過程中的核心調控網路，還識別出許多意想不到的因子和它們之間的複雜關聯。它能捕捉到同一蛋白複合體內部不同成員的差異化效應（如sf3b複合體），也能識別出直接效應器和間接調控者。

當然，relic作為一項新技術，也有其局限性，比如它目前依賴於異源表達的報告基因，並且需要位點特異性整合，這可能限制其在某些細胞類型中的應用。然而，研究人員已提出多種改進方向，包括：

引入更多基因編輯工具，如鹼基編輯器 (base editors) 和先導編輯 (prime editors)，以實現更高解析度的核苷酸層面的rna代謝研究。

使用非編碼rna (non-coding rnas) 和病毒rna作為報告基因，探索新型rna調控機制。

將relic文庫擴展到所有蛋白編碼基因，以揭示rna代謝與其他細胞過程之間更廣泛的相互作用。

總而言之，relic為我們提供了一個前所未有的強大工具，能夠大規模、高通量地「解碼」人類細胞中複雜的轉錄後調控網路。這項研究不僅加深了我們對生命基本過程的理解，也為未來開發針對rna代謝疾病的治療策略奠定了基礎。

參考文獻

nugent pj, park h, wladyka cl, yelland jn, sinha s, chen ky, bynum c, quarterman g, lee sc, hsieh ac, subramaniam ar. decoding post-transcriptional regulatory networks by rna-linked crispr screening in human cells. nat methods. 2025 may 29. doi: 10.1038/s41592-025-02702-6. epub ahead of print. pmid: 40442371.

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