2022年11月03日17:33:27 熱門 1583

曾聲稱可快速檢測新冠，檢測速度比熒光 PCR（聚合酶鏈式反應）快近 9 倍的 SHERLOCK 系統，自 5 月被 FDA 批准用於應急測試之後便在輿論環境中沉寂。

直到本周二，在一場線上分享會中，SHERLOCK 系統的主要開發者、CRISPR 應用領域的先驅之一張鋒再次露面，用近 40 分鐘的時間分享了這一新冠檢測神器背後的開發歷程和技術解決路徑。

SHERLOCK 系統基於基因編輯工具 CRISPR-Cas13，最初曾在多種人類樣本（如唾液）中發現寨卡、登革熱等病毒的 RNA 序列，甚至一些與癌症突變相關的序列，其對 RNA 和 DNA 的檢測靈敏度都達到了單分子級。

這種檢測方法與驗孕棒類似，只需一張試紙就能顯示出病毒感染檢測結果，在新冠病毒的檢測中，該技術只需 1 小時就能判斷是否存在新冠病毒。

「我們的產品通過兩步改造最終解決了兩個關鍵問題」，張峰在分享過程中說。

生輝全程記錄了張鋒的分享過程，以下為基於原意修改的分享實錄：

我之前一直在麻省理工學院的實驗室開發用於分子診斷的 CRISPR 輔助系統。幾年前，我們開發了 SHERLOCK，用於檢測 SARS 病毒和寨卡病毒等。今年年初，我在《紐約時報》讀到了對一種新型病毒的報道，也就是現在的新型冠狀病毒，當時在病毒出現的地方爆發了眾多連鎖反應。我想，也許可以利用 SHERLOCK 去檢測這種新型病毒。於是，我們的實驗室開始重新設計不同引物和 Guide-RNA (引導 RNA），希望能夠查明新冠病毒的部分序列。

但在幾個星期後，COVID-19 的病毒序列正式對外公布。1 月下旬，我開始收到很多來自中國同事的郵件，其中一位在武漢的同事在 2 月初給我發來這張他站在武漢火車站附近的照片，他說過去這裡人聲鼎沸，但因為新冠病毒的傳播我們不得不封鎖整個城市，你能不能與我們合作開發一種方法，在病毒傳播的初期實現快速診斷。

於是我們啟動了這一項目。

SHERLOCK 的工作原理如下，它需要兩步反應，首先是擴增，但 SHERLOCK 的擴增過程非常簡單，不需要 PCR 的過程，而是採用等溫擴增的方法。這就意味著病毒經過等溫擴增後，在 CRISPR 蛋白中加入一個 Guide-RNA 就可以準確識別病毒序列。在識別病毒序列的過程中，Cas 蛋白就不僅可以切割病毒序列，還可以切割探針進而讀出結果。

我們用的探針是一段兩端攜帶分子的較短的等位基因，這讓其可以在試紙上顯示結果。如果病毒存在就會看到兩條線，如果病毒不存在就只能看到一條線，這和驗孕試紙的運作方式十分類似。隨後，我們用開發的引物和 Guide-RNA 製作了簡易的檢測試劑盒，供全球的科學家和醫院使用，並開始收集試驗結果。

我們收到的第一組數據是來自於華盛頓大學的 Keith Jerome 和 Greninger 小組。

在 3 月，西雅圖是新冠病毒傳播最肆虐的區域之一，所以華盛頓大學的研究小組訪問了不同的病人樣本並用 SHERLOCK 系統展開檢測測試。他們發現通過鼻咽拭子提取唾液樣本後，SHERLOCK 能夠準確檢測出病毒。檢測試紙（下圖）顯示，上方出現的橫線代表病毒存在，下方的橫線是陽性對照，我們能夠看到在所有的陽性樣品上方都出現了檢測線。

除了和 Keith 的小組合作，另一個合作者也和上述團隊一同對 SHERLOCK 進行測試。他們從取樣測試中發現靈敏度相當不錯，能夠達到 93％，同時具有 100％的特異性，不會顯示假陽性信號。基於這些數據，他們開始申請許可並在泰國當地的醫院大範圍使用 SHERLOCK，我們也得到了有效的反饋（如下圖）。

根據不同的合作者的反饋，我們了解到 SHERLOCK 可以有效地檢測新冠病毒，但它仍有一個不容忽視的缺點。SHERLOCK 檢測是兩步反應，其中包含運行擴增、打開擴增管再將試劑移到第二個反應管中，之中隱藏著試劑污染的風險，這甚至會誘導產生假陽性。

所以我們嘗試解決這一問題，並開發了一個新的反應體系，我們稱之為 STOPCovid 1，這是 SHERLOCK 檢測的一個部分。我們將擴增過程和 CRISPR 檢測過程整合至單一反應中。它的工作原理是這樣的：通過鼻咽拭子收集唾液樣本，然後提取其中的 RNA，讓其進入拷貝反應並在 60°C 的環境中培養一個小時，最後將檢試紙直接放入反應管讀取病毒檢測結果。

但實現上述過程之前必須要解決一些問題。

第一，簡化病毒 RNA 的提取。早在 3 月或 4 月，RNA 提取試劑盒和提取柱非常短缺，因此我們開發了提取緩衝液，稱為快速提取（QuickExtract），通常用於分析病毒的 RNA 基因組。事實證明，QuickExtract 能夠快速分解鼻咽拭子的唾液並釋放病毒 RNA，無需基於提取柱純化等過程，同時我們發現，QuickExtract 和通過提取柱檢測的靈敏度水平表現相似（下圖）。

第二個問題，反應溫度。STOPCovid 1 的反應溫度是 60°C，而我們之前選用的 CRISPR 蛋白大部分都不穩定，它們的工作溫度是在 37°C。在 60°C 的條件下，蛋白會失去活性。所以我們從嗜熱細菌中尋找合適的蛋白，並發現了兩種合適的樣品：來自 Aac 細菌和 Aap 細菌的蛋白都能夠在 60° 下穩定存活，這樣我們就可以實現擴增和檢測的過程。從圖中可以看見 Aap 細菌的蛋白（藍線）的效果更好，穩定性也更強，我們用其檢測 200 份左右的樣品得到了下面的數據圖。

但我們仍希望讓檢測更加快速地進行，也能識別更多信號。為了達到這一目標，我們測試了不同的反應添加物，以增強反應過程。因此，我們訂購了多種不同的化合物以提高反應效率。通過系統的分析，發現甘氨酸（Glycine）和牛磺酸（Taurine）是效果最好的添加劑，可以同時增加反應速度、信號強度和反應容量。大家可能都聽說過牛磺酸，可以增強人體機能，讓我們能熬夜看論文（笑）。

以上是我們所做部分工作，我們將上述每一步改造過程結合起來開發了 STOPCovid 1 系統。我們也將他與 LAMP 檢測方式（環介導等溫擴增）進行了比較。從左圖中可以看到，隨著時間的推移，LAMP 會出現誤報信號。圖中右側的三條線顯示，它們的實際信號輸出低於檢測閾值。而右圖中數據顯示，如果添加了 CRISPR 蛋白和上述添加劑，可以擺脫假陽性信號，實現 100% 的檢測特異性。而這一反應甚至可以在簡易水浴環境下進行，低成本投入卻能獲得準確的檢測結果。

但與 SHERLOCK 系統相比，STOPCovid 1 系統雖然簡單便易，但檢測靈敏度仍未達到同等水平，因此，我們又開發了 STOPCovid 2 系統，利用磁性轉珠（BEAD）優化 RNA 提取和富集過程以提高特異性和敏感度。

STOPCovid 2 的主要工作方式是將鼻咽拭子樣本添加到反應管中，利用磁力控制實現病毒 RNA 的裂解，再利用 BEAD 「捕捉」 RNA 將其提取出。此時 RNA 的裂解緩衝液仍保留在 BEAD 上，但已經濃縮成較小的體積。加入 STOP Covid 反應試劑，充分溶解後可以用熒光或者試紙的方式進行檢測。

這是（下圖）STOPCovid 1 和 2 之間的對比，根據兩個不同的患者樣本。不難發現 STOPCovid 1 的檢測靈敏度與 RT-qPCR CT 值 30 相當。而 STOP Covid2 可以達到的 RT-qPCR CT 值為 40。所以基於 Covid-19 患者的輸入統計情況可以發現，如果 CT 值達到 40，則證明它可以成功檢測幾乎 100％的病人，如果 CT 值為 30，則證明只能成功捕獲 60％的患者。所以將 CT 值提高至 40-50 左右非常重要。值得注意的是， CT 值達到 40 的患者感染力可能有所減弱，因為病毒向環境擴散的能力顯著降低。

隨後，我們的合作者展開了系統的測試，他們共檢測的 400 余個樣本，其中包含 202 個陽性樣本和 200 個陰性樣本。結果顯示，STOPCovid 2 能夠得到 93.1% 的靈敏度和 98.5% 的特異性，檢測結果與 RT-qPCR 檢測的靈敏度和特異性幾乎一致。

這是其中 200 個樣本檢測結果，可以看到在遠端才出現了個別假陽性情況。

隨後，我們又將患者打散再次進行測試。左側顯示在陰性測試中，患者均無法檢測出病毒，右側的陽性患者中，能夠檢測出積極的信號。檢測的 CT 範圍在 20-35.7 之間。

目前，我們已經在開發設計一種小型的檢測儀器，不需要移液器等設備就能實現檢測。我們設計的工作方式是，儀器中將包含一個富集管，操作人可以將蘸有唾液的棉簽直接插入溶解病毒的富集管內，提取後將病毒溶解在提取緩衝液中，最後插入設備運行 30 分鐘就能完成測試。我希望這能幫助人們以一種非常簡單的方式檢測新冠，尤其是護理機構和家庭中能夠實現快速檢測。

我的分享就到這裡，我們將繼續努力。我想感謝我的實驗室成員和合作者，以及那些支持這項工作的資助機構，謝謝。

在隨後提問環節中，張峰也回答了一些觀眾提問，內容整理如下：

提問：能檢測到多大的病毒 RNA 片段？

張鋒：STOP Covid 中的 Guide-RNA 是一段 24 個鹼基配對的序列，我們用它來識別部分病毒，但只是其中一個引物，我們其實用了六個不同的引物以擴大檢測片段，其中包含 2 輪檢測，這就是為什麼 STOP Covid 能夠得到更好的靈敏度。

提問：檢測價格估計會是多少錢？

張鋒：檢測費用取決於測試的規模。酶、Guide-RNA、引物等都需要生產，每次檢測的價格或許在一美元左右，或者稍多於一美元，如果能夠實現規模化的製造，檢測的價格可能會更便宜，

提問：甘氨酸和牛磺酸的工作原理是什麼？

張鋒：我們目前也不太清楚甘氨酸和牛磺酸的工作原理，它們可能起到維持蛋白質穩定性的作用，以確保他們在反應中更穩定。我們測試的添加劑是可商購的，一共有 96 種，包含凍干試劑、優化特定反應的生化試劑，甚至是結晶體。

提問：有一個瑞士的研究小組將納米金顆粒生物感測器用於環境內新冠病毒含量的監測中，在實現這一目的之前需要完成哪些必要的步驟？

張鋒：所有這些環境監測項目都可以使用分子檢測方法來完成，無論是 PCR、等溫擴增甚至是基於等溫擴增的 CRISPR 檢測。最初的步驟是收集環境中的樣品並將其濃縮，目前已經有很多設備可以實現這一過程，例如 RNA 提取柱可以將較大的輸入量濃縮到較小的體積中，如果這些方法能夠增加測試的靈敏度，我們都可以去嘗試。

當然，研究人員已經使用這種方法來測試廢水，麻省理工學院的一位教授一直在使用 PCR 檢測法來尋找廢水樣本中新冠病毒。這一研究也在馬薩諸塞州污水處理局網站線上發布，你可以去看看。而隨著 Covid-19 在美國的傳播可以看到污水內病毒含量的增加和降低，這一數據可以用於監測陽性病例患者的數量變化，這些都是非常有用的應用。

提問：新冠肺炎不是我們最後一次遇到的傳染病，這種檢測方式對我們日常遇到的其他病毒是否有效？

張鋒：檢測中的反應是一個通用的分子擴增反應過程，所以假設病毒的 DNA 或 RNA 可以從病毒顆粒中釋放出來，那麼就應該可以讀取它。但有一個挑戰是，你從病人身上收集的病毒或樣本可能含有抑製劑，會阻止擴增或阻止脆性病毒的檢測。因此，有不同的方法去降解抑制物。第一種，添加裂解蛋白的蛋白酶後在進行複製檢測。第二種，檢測過程中可能存在小分子化合物，因此你可能需要用到過濾器等設備，降低抑製劑的含量。

提問：檢測出的陽性信號對確定病毒含量來說是否有價值？它是否處於線性動態範圍內？

張鋒：有這個可能性。我們已經發現將 LAMP 和 CRISPR 反應結合會得到一種類似二進位的信號 —— 陰性或陽性。但當病毒載量變大，高病毒負載的信號出現的時間會比較慢，低病毒負載的信號出現時間會比較長。我認為有可能生成一條以不同輸入濃度為變數的標準曲線。我們在弄清楚檢測信號的上升時間，也許可以用它來推斷病毒載量。

目前我們還沒有足夠的病人樣本數據，還無法證實這一情況，其中最重要的變數是在患者樣本中可能含有的抑製劑數量，所以我認為對於純化的 RNA 樣本可以建立一個標準曲線，但對於病人樣本，我們還需要做更多工作。

提問：可以一次性檢測多種病毒嗎？

張鋒：這是有可能的。可以使用多個 CRISPR 蛋白，多路裂解 RNA 或 DNA。例如可以一個用於流感，一個用於 Covid-19，一個用於呼吸道融合病毒 RSV 等，每一種病毒會發出不同的顏色作為信號，利用這一點來實現多路復用，檢測多種病毒。

提問：與 CRISPR Cas12a 檢測相比，主要功能差異是什麼？

張鋒：在反應中我們使用 Cas12b 作為 CRISPR 蛋白，原因是部分 Cas12b 來自嗜熱細菌，這讓其能夠在 60℃下工作。Cas12a 在 37℃下可以工作，但是在 60℃下就不行了。這也是之所以我們用 Cas12b 的原因。