天然骨组织是由无机矿物质和有机胶原组成的，其中的胶原/HA复合物赋予天然骨组织压电特性。在缺损部位通过压电材料重建生理电微环境的应用是促进成骨的有效策略，特别是在成骨的初始阶段。由此模仿天然骨的组成和压电特性的仿生支架为再生医学提供了一种有前途的策略；然而选择合适的压电材料来满足再生过程中的不同需求也是一项挑战。
基于此，来自北京化工大学的Yingjie Yu、蔡晴团队开发了一种基于压电WH(PWH)的多功能仿生复合支架。作为掺镁磷酸钙，退火的WH在相变温度以上也由于畴转变而显示出显著的极化，这使得PWH与天然骨的电活性特性匹配良好，从而增强成骨作用。相关研究成果以“A biomimetic piezoelectric scaffold with sustained Mg2+ release promotes neurogenic and angiogenic differentiation for enhanced bone regeneration”为题于2022年11月29日发表在《Bioact. Mater.》上。
图1 PWH压电复合支架的骨修复应用
- 3D打印支架的制造和表征
首先，作者通过熔融挤压3D打印技术开发了一种具有压电性和持续释放生物活性离子的骨修复支架。利用化学沉淀法合成了WH压电纳米粒子（图2A）。SEM表明WH纳米颗粒显示了菱形形态，β-TCP纳米粒子呈球形；EDS证实了钙和磷元素在WH和β-磷酸三钙纳米颗粒中的存在，而镁元素仅在WH纳米颗粒中发现（图2B）。之后，对材料的电活性进行了表征，说明了压电PWH纳米颗粒在修复局部内源性电微环境方面比WH纳米颗粒和β-TCP纳米颗粒更有优势（图2C-D）。力学测试表明支架的机械性能在相同的范围内；此外，作者还监测支架浸入PBS中Mg2+和Ca2+的释放特性，退火处理不会损害支架的离子释放特性。上述结果共同证明了PWH支架显示出优异的压电性和生物活性离子的持续释放，这有望有益于骨再生。
图2 PWH纳米粒子和PWH复合支架的制备与表征
- 支架的生物相容性评价
在将这些支架用于细胞接种之前，作者将其在室温下用NaOH溶液轻微蚀刻以增加表面亲水性。通过使用CCK-8分析和荧光染色对细胞的存活进行了表征，骨髓间充质干细胞在各种支架上生长良好，所有组显示主要为绿色荧光，因此表明所有支架具有优异的生物相容性(图3)。这些结果共同证明，与β-TCP和WH支架相比，压电PWH支架在细胞增殖中具有相似的行为。
图3 不同支架的生物相容性评价
- Mg2+/压电对神经新生和血管新生的协同作用
骨愈合是一个复杂的信号级联过程，涉及神经再生和血管生成，是形成神经血管化骨组织不可或缺的事件。因此，作者继续研究PWH支架的压电性及其Mg2+的持续释放对其影响。通过将BMSCs直接接种在支架上，对细胞的神经源性和血管源性分化进行定量和定性评估(图4A)。对于神经源性分化研究，应用实时qPCR定量三个相关基因进行表达分析。PWH支架比WH支架对骨髓间充质干细胞的神经源性分化具有更强的诱导性。在PWH支架组中，巢蛋白、TUBB3和NEFL的表达分别是WH支架组的1.7、1.3和1.6倍，显然这种增强可以归因于Mg2+/压电的协同效应（图4B-D）。
图4 不同支架上培养的骨髓间充质干细胞的神经源性和血管源性分化
此外，作者还进一步利用CAM模型评估血管的形成(图5A)。如图5B所示，在PWH支架中可以观察到最丰富的血管形成，其次是WH支架，而在β-TCP和PCL支架中只观察到有限的血管生成，来自PWH和WH支架的提取物显示出比β-TCP和PCL支架组更强的诱导血管生成的潜力（图5C-F）。总的来说:Mg2+协同压电效应可在促进神经发生和血管生成方面发挥协同作用。
图5 使用CAM模型检测各种支架的血管生成
- 支架对骨髓间充质干细胞成骨分化的影响
随后，作者为了验证支架中可溶性成分(即释放的离子)对成骨的影响，在各种支架存在的情况下，将骨髓间充质干细胞培养在TCP上7天或14天。然后，取下支架，用ALP染色对TCP上的骨髓间充质干细胞进行表征，证实了释放的Mg2+从WH和PWH支架进入培养基进一步促进了细胞ALP活性（图6A-B），同时成骨活性表达也呈现了最好的结果。
图6 不同支架条件下骨髓间充质干细胞成骨分化的评价
- 原位骨再生评估
最后，作者探索了PWH支架的在大鼠颅骨缺损模型的诱导骨再生能力（图7A）。结果表明PCL和β-TCP支架几乎不诱导新骨组织的形成，在8 W后仍在缺损区域显示孔，而没有显示β-TCP支架的存在。然而，WH和PWH支架都在缺损的中心区域诱导了明显的骨形成，从缺损边缘萌发并生长到支架框架中，在PWH支架组中可以观察到最显著的新骨形成，BV/TV和BMD的定量分析也进一步支持了这一点。
图7 原位骨再生的评价
随后，作者通过H&E和Masson三色染色用于说明与支架植入相关的可能炎症反应，以及显示胶原合成和骨成熟（图8）。所有组均未观察到明显的炎症，表明含有各种无机纳米粒子的植入支架具有良好的生物相容性。新骨生长到压电PWH支架的内部，而PCL和β-TCP支架则没有。此外，WH和PWH支架组表现出比PCL和β-TCP支架组更强的OCN和更少的TRAP表达，其中PWH支架表现出最强的成骨诱导能力。
图8 评估骨再生的组织学、免疫组织学和免疫荧光染色
综上，本文设计了一种仿生支架，通过引入电活性PWH纳米粒子来模仿天然骨的组成和压电性。PWH支架显示出显著的压电性和生物活性离子的持续释放。利用这种协同效应，PWH支架模仿天然骨的功能，增强血管生成，促进神经元分化，抑制破骨细胞活化，最终增加成骨。与其他支架相比，这些特点使得PWH支架在促进神经血管化骨再生方面具有很强的能力，大鼠颅骨缺损模型支持了这一点。总的来说，这种骨特异性的含有电活性PWH的复合支架为骨化提供了一种综合有效的策略。
文章来源：https://doi.org/10.1016/j.bioactmat.2022.11.004
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