大家好，今天推送的文章发表在Nature Communications 上的“Continuous evolution of a halogenase enzyme with improved solubility and activity for sustainable bioproduction”。
卤化反应能增强药物和生物材料的功能，但现有卤化酶（如色氨酸卤化酶RebH）存在溶解度低、活性差、温度敏感等问题，严重限制了其在体内的应用。本研究开发了一种基于氨酰‑tRNA合成酶（aaRS）的生物传感器，将7‑氯色氨酸（7‑Cl‑Trp）的生成与sfGFP荧光偶联，实现对卤化酶活性的高通量检测。随后将该传感器改造为M13噬菌体依赖的筛选系统，通过噬菌体辅助连续进化（PACE）对RebH进行超过500小时的定向进化，最终获得含有12个突变的变体RebHEvo4。该变体在37°C下催化7‑Cl‑Trp和7‑Br‑Trp的产量分别比野生型提高37倍和44倍，且溶解度显著提升。在5 L补料分批生物反应器中，RebHEvo4可生产2.7 g/L的7‑Cl‑Trp。将其与色氨酸脱羧酶RgnTDC偶联，卤化色胺产量提高24‑36倍；用于抗菌肽的位点特异性卤化修饰，可实现无需外源非天然氨基酸的高效生物合成。本研究为绿色生物制造卤化药物和肽类提供了高效酶工具。
卤化化合物在现代医药和农业中占据核心地位：约25%的上市药物和超过80%的农用化学品含有卤素原子，可显著提高生物利用度和稳定性。传统的化学卤化方法常需苛刻的腐蚀性试剂，且缺乏区域和对映选择性。酶促卤化作为一种绿色、区域选择性的替代策略备受关注，其中以色氨酸卤化酶（如RebH）研究最为深入。RebH利用黄素辅因子原位生成次卤酸（HOX），在色氨酸吲哚C7位进行亲电卤化。然而，该类酶普遍存在溶解性差、催化活性低、底物抑制和温度敏感等问题，导致体内发酵产量极低（通常为毫克级），反应速率缓慢。尽管前期通过定向进化已获得部分热稳定性或底物谱拓宽的变体，但尚无同时提高溶解性和体内活性的报道；实际应用中仍需依靠融合促溶标签或共表达分子伴侣来部分克服缺陷。因此，亟需开发一种能够直接筛选高活性、高溶解度卤化酶的体内连续进化策略，以实现卤化化合物的大规模可持续生物制造。
1
基于氨酰‑tRNA合成酶的生物传感器用于体内卤化活性检测
研究 利用已报道的嵌合氨酰‑tRNA合成酶ChPheRS‑4（可特异性识别7‑Cl‑Trp并将其掺入蛋白质琥珀终止密码子TAG位点），构建了卤化活性生物传感器。将sfGFP基因第151位引入TAG终止密码子（GFP‑151‑TAG），只有当细胞内存在7‑Cl‑Trp时，ChPheRS‑4才能介导TAG通读，产生全长sfGFP并发出荧光（图1A）。通过引入文献中的两个改进突变（aaRS的S333C和tRNA的3C1128），显著提高了琥珀抑制效率。比较五种不同培养基，发现DRM与M9以1:9混合时，在保证低渗漏的同时获得最高GFP信号（图1B、1C）。该传感器在30°C下可检测低至1 μM的7‑Cl‑Trp（信噪比9倍），最高线性范围125‑250 μM（信噪比95倍）。加入外源色氨酸会竞争性抑制传感器，说明该aaRS对非卤化底物无混杂性。在34°C和37°C时琥珀抑制效率下降，但无外源7‑Cl‑Trp时仍无背景信号（图1D）。将RebH与黄素还原酶Fre共表达后，细胞内产生的7‑Cl‑Trp能驱动GFP信号达到与外源添加相当的水平，而对照（MBP替代RebH）无信号（图1E）。该传感器为卤化酶活性的高通量体内评估提供了可靠工具。
图 1：基于氨酰‑tRNA合成酶（AARS）的生物传感器及卤化生物合成回路。
2
依赖于卤化活性的噬菌体传播系统
为实现噬菌体辅助连续进化（PACE），将上述传感器的GFP读出示改造为M13噬菌体繁殖依赖的信号。将RebH基因置于噬菌体基因组中（替代pIII基因），同时在宿主细胞内通过两个辅助质粒提供：质粒1表达ChPheRS‑4（含S333C）及其同源tRNA；质粒2表达Fre以及一个在第29位含有TAG终止密码子的pIII基因（pIII‑TAG29）（图2A）。只有当噬菌体表达的RebH催化生成7‑Cl‑Trp并被aaRS掺入pIII蛋白中，pIII才能被翻译，从而支持噬菌体扩增。噬菌体斑块实验证实，携带RebH的噬菌体可在不外加7‑Cl‑Trp时形成斑块，而空噬菌体（无RebH）仅在添加7‑Cl‑Trp时才能繁殖（图2B）。温度依赖性实验显示，在30°C下，RebH噬菌体可高效繁殖；34°C时繁殖受限但仍可检测；37°C时仅外加7‑Cl‑Trp才能繁殖（图2C）。该结果为在34°C起始温度下对RebH进行PACE进化奠定了基础。
图 2：基于M13噬菌体的卤化酶基因回路。
3
噬菌体辅助连续进化RebH
研究 对RebH进行了总计560小时的连续流动进化，分为三个阶段（图3A）。第一阶段：以野生型RebH为起点，在34°C启动，利用携带诱变质粒MP6的宿主实现体内持续突变，并逐渐将温度升至37°C以筛选热稳定性变体。运行240小时后，对24个克隆噬菌体测序，发现两个共同固定突变V256I和T385I（>50%频率），另有T348A、M430L、L188F、L380F等未固定。将V256I、T385I与T348A、M430L组合获得四突变体RebHEvo1，GFP信号显著提高（图3C、3D）。第二阶段：以 RebHEvo1 为模板构建易错PCR文库，进化120小时后测序40个克隆，未出现固定突变，但富集了D101N、A16S、A32V、A50T、T496R等突变，且多个独立克隆在空间相近位置出现突变（如D101N与G102S，T496R与Q494K）。通过组合筛选获得包含7个突变的 RebHEvo2 ，再进一步加入Q494K、T496R等表面电荷突变和L233M，得到10个突变的 RebHEvo3 ，活性最高。第三阶段：以 RebHEvo3 为模板再次文库进化200小时，获得一个固定突变P416S及其他富集突变，最终组合12个突变（A16S、A32V、D101N、V256I、Q323H、N326K、T348A、T385I、P416S、M430L、Q494K、T496R），命名为 RebHEvo4 ，其GFP信号比野生型提高5倍（图3D）。结构分析显示，突变分布在蛋白表面、内部及黄素结合口袋附近（图3E）。
图 3：RebH卤化酶的噬菌体辅助连续进化（PACE）。
4
进化变体RebHEvo4比野生型更可溶且活性更高
研究 在Δ tnaA菌株中表达RebHEvo4与Fre，以全细胞催化方式测定7‑卤代色氨酸产量。在37°C下，RebHEvo4生产7‑Cl‑Trp的产量比野生型提高37倍，生产7‑Br‑Trp提高44倍；即便将野生型置于其最适温度30°C，RebHEvo4 在37°C下的产量仍高12倍（氯代）和11倍（溴代）（图4A、4B）。SDS‑PAGE显示RebHEvo4 的可溶性组分远高于野生型（图4C）。体外纯酶动力学测定表明，在饱和色氨酸条件下，RebHEvo4 的表观 k cat 比野生型提高约2.5倍（氯化和溴化均在30°C和37°C下），说明催化效率本身也得到改善。区域选择性未改变，仍专一在C7位卤化。将Fre与RebH通过L3 linker融合表达可进一步提高活性（野生型和Evo4分别提高1.5倍和1.7倍），表明存在底物通道效应（图4D）。与两个前期报道的体外热稳定性变体（3‑LR和3‑LSR）相比，RebHEvo4 在体内活性远优于它们。在优化aaRS（引入M490L）后，RebHEvo4 在37°C下可实现含单个TAG的sfGFP 100%琥珀抑制，含三个TAG时达20%抑制，而野生型仅22%（单TAG）。质谱证实sfGFP正确掺入了7‑Cl‑Trp和7‑Br‑Trp（图4E）。综上，RebH Evo4 兼具高溶解度、高催化活性和高温适应性。
图 4：进化卤化酶RebHEvo4的表征。
5
利用RebHEvo4高效生产卤化生物分子和肽
研究首先将RebHEvo4与色氨酸脱羧酶RgnTDC在同一个细胞内共表达，构建从色氨酸到卤化色胺的完整代谢途径。在全细胞催化条件下，RebHEvo4使7‑氯色胺和7‑溴色胺的产量分别比野生型提高24倍和36倍（图5A），表明该酶的改进可推广至非天然产物。随后在5 L补料分批生物反应器中，采用诱导型启动子（proK‑lacO）控制Fre‑RebHEvo4表达，以相对溶氧控制补料，在37°C下约30小时获得2.7 g/L（约12 mM）的7‑Cl‑Trp（图5B），为目前报道的最高发酵滴度。进一步将RebHEvo4应用于抗菌肽（AMP）的位点特异性卤化。设计了一种“自杀”筛选体系，将编码AMP的基因中特定色氨酸密码子改为TAG，在卤化酶和aaRS存在下，只有正确掺入7‑Cl‑Trp的全长AMP才能抑制宿主生长（图5C）。以Enterocin RJ‑11为模型，分别对其三个色氨酸（W12、W30、W38）进行氯代修饰，发现W30氯代变体保持与野生型相当的抑菌活性（图5D、5E）。随后利用SUMO融合表达系统，在E. coli中生产了Trp30‑氯代的Enterocin RJ‑11，经纯化和质谱确认正确修饰（图5F、5G）。膜完整性荧光显微镜实验证实，生物合成的氯代肽与化学合成对照具有相同的膜损伤机制（图5H）。该工作展示了利用进化卤化酶无需外源添加昂贵非天然氨基酸，即可实现活性卤化肽的体内筛选和规模化生物制造。
图 5：卤化生物分子及卤化抗菌肽的生物制造。
本研究针对色氨酸卤化酶RebH溶解性差、活性低、温度敏感等瓶颈，开发了基于氨酰‑tRNA合成酶的生物传感器，并利用噬菌体辅助连续进化（PACE）技术，经过560小时定向进化获得含12个突变的变体RebHEvo4。该变体在37°C下催化7‑氯色氨酸和7‑溴色氨酸的产量分别较野生型提高37倍和44倍，且溶解度显著提升。在5 L生物反应器中实现了2.7 g/L的7‑氯色氨酸发酵生产，为目前最高报道水平。将RebHEvo4与脱羧酶偶联可高效生产卤化色胺，并首次实现了抗菌肽的位点特异性卤化修饰及无需外源非天然氨基酸的体内生物合成。该工作为绿色生物制造卤化药物和肽类提供了高效酶工具。
https://www.nature.com/articles/s41467-026-70981-4
