撰文 | 言笑
急性髓系白血病（Acute Myeloid Leukemia, AML）的特点是未成熟髓系前体的克隆增殖伴随分化受阻。与正常的造血作用类似，AML按层次结构组织，白血病干细胞（leukemic stem cells, LSCs）负责补充AML细胞的大量种群并驱动长期克隆增殖【1-2】。干细胞在正常和恶性造血作用中都具有非常重要的作用，但调节LSCs和正常干细胞生长和分化的因素尚未完全阐明。
线粒体中产生的代谢中间体（包括乙酰辅酶A、α酮戊二酸、S-腺苷甲硫氨酸和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸）通过作为核基因表观遗传修饰的辅助因子来调节干细胞功能和分化【3-4】。代谢酶（如IDH1和IDH2）的突变会产生肿瘤代谢物，导致组蛋白和DNA甲基化增加，促进白血病发生并抑制分化【5-6】。虽然已有研究证实代谢产物调节干细胞功能，但对于定位在细胞核中的直接影响基因表达、细胞分化和干细胞功能的线粒体代谢酶知之甚少。
近日，来自加拿大玛格丽特公主癌症中心的Aaron D. Schimmer团队在Nature Cell Biology杂志上在线发表了题为The metabolic enzyme hexokinase 2 localizes to the nucleus in AML and normal haematopoietic stem and progenitor cells to maintain stemness的文章。研究人员发现，糖酵解途径中的起始酶和限速酶己糖激酶 2（hexokinase 2, HK2）可以定位于AML和正常造血功能的干细胞和祖细胞的细胞核中。细胞核HK2以不依赖其激酶和代谢功能的方式调控干细胞/祖细胞功能和分化。该研究描述了一种线粒体酶调节基因表达和干细胞功能的非经典机制。
为了探究那些传统定位于线粒体的代谢酶是否可以在细胞核中兼职（moonlight in the nucleus）并直接影响干细胞功能和分化，作者对8227细胞（这是一种低传代原代AML模型【7】）中的线粒体糖酵解酶和三羧酸循环酶进行了分析，并在细胞核中检测到了HK2（糖酵解途径中的第一个酶，它将葡萄糖转化为葡萄糖-6-磷酸）。相比之下，其他代谢酶（包括磷酸果糖激酶、延胡索酸酶、丙酮酸激酶2等）在核裂解液中并未检测到。随后，作者在7个原发性AML样本中也检测到了核HK2。进一步，根据活性氧水平的高低，作者将原发性AML样本分细分为白血病干细胞（stem population）和大量群体（bulk population），并检测了这两组样品中的核HK2水平。与bulk cells相比，stem cells中的核HK2显著增强。
那么AML干细胞和祖细胞功能是否需要核HK2? 作者构建了c-Myc（NLS1, PAAKRVKLD）或SV40（NLS2, PKKKRKV）核定位信号标记的HK2，选择性地增加细胞核中的HK2，发现核HK2过表达可以促进8227细胞植入小鼠骨髓。从第一受体骨髓中采集8227细胞继续移植到第二受体，核HK2过表达依旧可以提高植入效率。OMMLS-HK2（outer mitochondrial membrane-localizing signal, OMMLS）可以选择性地定位到线粒体中。与对照细胞相比，表达OMMLS-HK2的细胞对2-脱氧-D-葡萄糖（2-DG）具有更强的抵抗性（图1a和b），表明线粒体标记的蛋白质具有代谢活性。随后，作者用靶向内源HK2的shRNA转导过表达OMMLS-HK2的细胞以消除核HK2，同时保留线粒体中的HK2（图1c）。结果显示，核HK2敲低后，（1）降低了NB4细胞的克隆生长（图1d）和8227 LSCs（CD34+CD38-）数量（图1f）；（2）减少了AML细胞在体内的生长和移植；（3）降低了与原始/干细胞样AML组分相关基因的表达，增加了细胞对ATRA（all-trans-retinoic acid, 全反式维甲酸）的敏感性（图1d和e）；（4）降低了ATRA处理后CD34+ CD38−干细胞的百分比（图1f）。这些数据表明，核HK2对于AML中的干细胞功能和分化至关重要。
图1. 敲低核HK2降低干细胞和祖细胞功能
作者还探究了HK2在正常造血干细胞和祖细胞中的核表达和功能。造血干细胞（hematopoietic stem cells, HSCs）和多能祖细胞中HK2的核表达水平和总水平均较高，并随着细胞成熟而下降，分化细胞中核HK2的表达量最小。正常脐带血中核HK2的过表达增加了这些细胞移植到小鼠体内的原发性和次级移植率。进一步，作者构建了过表达核HK2的转基因小鼠（Vav-NLS-HK2），选择性地增加造血系统中的HK2。Vav-NLS-HK2小鼠骨髓中HSCs丰度及增殖能力显著增加，表明核HK2对正常HSCs的功能也很重要。
HK2是一种转移酶激酶，可将线粒体外膜处的葡萄糖磷酸化为葡萄糖-6-磷酸，起始糖酵解。那么HK2激酶活性是否是维持干细胞特性所必需的？Asp209和Asp657（D209A/D657A）的双重突变将使HK2完全丧失激酶活性。作者构建了一个带有c-Myc NLS标记的HK2突变体（NLS1-HK2 D209A/D567A）。在细胞中过表达NLS1-HK2 D209A/D567A后，用ATRA进行处理，依旧可以增强克隆生长和阻断细胞分化，与过表达野生型核HK2的表型类似。因此，核HK2以一种不依赖于其激酶和代谢活性的方式维持干细胞和祖细胞功能。
最后，作者分析了HK2维持细胞干性的机制。通过BioID（proximity-dependent biotin labelling）联合蛋白质谱初步筛选出12个与核HK2相互作用的蛋白，它们与染色质组织和调节（CTR9，MAX，PHF8，PHF10和SPIN1）、转录调控（AASDH，CCNL2，IWS1和ZNF136）和DNA损伤反应（SIRT1，TDP2和UBR5）相关。进一步通过原位邻位连接分析（Proximity ligation assay, PLA）证实了HK2与MAX、SIRT1、IWS1、CTR9和SPIN1之间的相互作用。随后，作者通过ATAC-seq发现，核HK2的过表达增加了染色质的可及性。HK2与MAX相互作用，MAX与细胞增殖、干细胞维持和分化以及DNA损伤响应有关，作者因此检测了stem和bulk AML群中的DNA损伤响应，并探究了核HK2是否会影响DNA损伤修复。在细胞中过表达核HK2后，用daunorubicin（一种插入化疗剂，可导致双链DNA断裂）处理细胞；然后，通过量化细胞核中γH2AX（双链断裂的替代标志物）、53BP1（介导非同源末端连接修复）和RAD51（同源重组）水平，在daunorubicin处理后的多个时间点检测双链DNA断裂和DNA修复蛋白的表达。结果显示，核HK2过表达增加了53BP1和RAD51水平，并减少了双链断裂的数量。作者还比较了AML stem与bulk细胞中的DNA损伤反应。白血病干细胞对 DNA 损伤有反应，与同源重组和非同源末端连接相关的基因表达增加。
综上所述，该研究描述了线粒体代谢酶HK2的非经典功能（兼职“moonlighting”功能）：（1）HK2定位于白血病和正常造血干细胞的细胞核；（2）核HK2过表达可以增加白血病干细胞特性并降低分化；敲低细胞核HK2促进分化并降低干细胞功能；（3）核HK2调控干细胞功能和分化不依赖于其激酶活性和代谢功能；（4）HK2与调节染色质开放性的核蛋白相互作用，增加DNA修复位点的染色质可及性；（5）核HK2过表达可减少DNA双链断裂并赋予化学抗性，这有助于理解白血病干细胞抵抗DNA损伤剂的机制。
原文链接:
https://doi.org/10.1038/s41556-022-00925-9
制版人：十一
参考文献
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5. Ward, P. S. et al. The common feature of leukemia-associated IDH1 and IDH2 mutations is a neomorphic enzyme activity converting α-ketoglutarate to 2-hydroxyglutarate. Cancer Cell 17, 225-234 (2010).
6. Figueroa, M. E. et al. Leukemic IDH1 and IDH2 mutations result in a hypermethylation phenotype, disrupt TET2 function, and impair hematopoietic differentiation. Cancer Cell 18, 553-567 (2010).
7. Lechman, E. R. et al. miR-126 regulates distinct self-renewal outcomes in normal and malignant hematopoietic stem cells. Cancer Cell 29, 214-228 (2016).
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