天然骨組織是由無機礦物質和有機膠原組成的，其中的膠原/HA複合物賦予天然骨組織壓電特性。在缺損部位通過壓電材料重建生理電微環境的應用是促進成骨的有效策略，特別是在成骨的初始階段。由此模仿天然骨的組成和壓電特性的仿生支架為再生醫學提供了一種有前途的策略；然而選擇合適的壓電材料來滿足再生過程中的不同需求也是一項挑戰。
基於此，來自北京化工大學的Yingjie Yu、蔡晴團隊開發了一種基於壓電WH(PWH)的多功能仿生複合支架。作為摻鎂磷酸鈣，退火的WH在相變溫度以上也由於疇轉變而顯示出顯著的極化，這使得PWH與天然骨的電活性特性匹配良好，從而增強成骨作用。相關研究成果以「A biomimetic piezoelectric scaffold with sustained Mg2+ release promotes neurogenic and angiogenic differentiation for enhanced bone regeneration」為題於2022年11月29日發表在《Bioact. Mater.》上。
圖1 PWH壓電複合支架的骨修復應用
- 3D打印支架的製造和表徵
首先，作者通過熔融擠壓3D打印技術開發了一種具有壓電性和持續釋放生物活性離子的骨修復支架。利用化學沉澱法合成了WH壓電納米粒子（圖2A）。SEM表明WH納米顆粒顯示了菱形形態，β-TCP納米粒子呈球形；EDS證實了鈣和磷元素在WH和β-磷酸三鈣納米顆粒中的存在，而鎂元素僅在WH納米顆粒中發現（圖2B）。之後，對材料的電活性進行了表徵，說明了壓電PWH納米顆粒在修復局部內源性電微環境方面比WH納米顆粒和β-TCP納米顆粒更有優勢（圖2C-D）。力學測試表明支架的機械性能在相同的範圍內；此外，作者還監測支架浸入PBS中Mg2+和Ca2+的釋放特性，退火處理不會損害支架的離子釋放特性。上述結果共同證明了PWH支架顯示出優異的壓電性和生物活性離子的持續釋放，這有望有益於骨再生。
圖2 PWH納米粒子和PWH複合支架的製備與表徵
- 支架的生物相容性評價
在將這些支架用於細胞接種之前，作者將其在室溫下用NaOH溶液輕微蝕刻以增加表面親水性。通過使用CCK-8分析和熒光染色對細胞的存活進行了表徵，骨髓間充質幹細胞在各種支架上生長良好，所有組顯示主要為綠色熒光，因此表明所有支架具有優異的生物相容性(圖3)。這些結果共同證明，與β-TCP和WH支架相比，壓電PWH支架在細胞增殖中具有相似的行為。
圖3 不同支架的生物相容性評價
- Mg2+/壓電對神經新生和血管新生的協同作用
骨癒合是一個複雜的信號級聯過程，涉及神經再生和血管生成，是形成神經血管化骨組織不可或缺的事件。因此，作者繼續研究PWH支架的壓電性及其Mg2+的持續釋放對其影響。通過將BMSCs直接接種在支架上，對細胞的神經源性和血管源性分化進行定量和定性評估(圖4A)。對於神經源性分化研究，應用實時qPCR定量三個相關基因進行表達分析。PWH支架比WH支架對骨髓間充質幹細胞的神經源性分化具有更強的誘導性。在PWH支架組中，巢蛋白、TUBB3和NEFL的表達分別是WH支架組的1.7、1.3和1.6倍，顯然這種增強可以歸因於Mg2+/壓電的協同效應（圖4B-D）。
圖4 不同支架上培養的骨髓間充質幹細胞的神經源性和血管源性分化
此外，作者還進一步利用CAM模型評估血管的形成(圖5A)。如圖5B所示，在PWH支架中可以觀察到最豐富的血管形成，其次是WH支架，而在β-TCP和PCL支架中只觀察到有限的血管生成，來自PWH和WH支架的提取物顯示出比β-TCP和PCL支架組更強的誘導血管生成的潛力（圖5C-F）。總的來說:Mg2+協同壓電效應可在促進神經發生和血管生成方面發揮協同作用。
圖5 使用CAM模型檢測各種支架的血管生成
- 支架對骨髓間充質幹細胞成骨分化的影響
隨後，作者為了驗證支架中可溶性成分(即釋放的離子)對成骨的影響，在各種支架存在的情況下，將骨髓間充質幹細胞培養在TCP上7天或14天。然後，取下支架，用ALP染色對TCP上的骨髓間充質幹細胞進行表徵，證實了釋放的Mg2+從WH和PWH支架進入培養基進一步促進了細胞ALP活性（圖6A-B），同時成骨活性表達也呈現了最好的結果。
圖6 不同支架條件下骨髓間充質幹細胞成骨分化的評價
- 原位骨再生評估
最後，作者探索了PWH支架的在大鼠顱骨缺損模型的誘導骨再生能力（圖7A）。結果表明PCL和β-TCP支架幾乎不誘導新骨組織的形成，在8 W後仍在缺損區域顯示孔，而沒有顯示β-TCP支架的存在。然而，WH和PWH支架都在缺損的中心區域誘導了明顯的骨形成，從缺損邊緣萌發並生長到支架框架中，在PWH支架組中可以觀察到最顯著的新骨形成，BV/TV和BMD的定量分析也進一步支持了這一點。
圖7 原位骨再生的評價
隨後，作者通過H&E和Masson三色染色用於說明與支架植入相關的可能炎症反應，以及顯示膠原合成和骨成熟（圖8）。所有組均未觀察到明顯的炎症，表明含有各種無機納米粒子的植入支架具有良好的生物相容性。新骨生長到壓電PWH支架的內部，而PCL和β-TCP支架則沒有。此外，WH和PWH支架組表現出比PCL和β-TCP支架組更強的OCN和更少的TRAP表達，其中PWH支架表現出最強的成骨誘導能力。
圖8 評估骨再生的組織學、免疫組織學和免疫熒光染色
綜上，本文設計了一種仿生支架，通過引入電活性PWH納米粒子來模仿天然骨的組成和壓電性。PWH支架顯示出顯著的壓電性和生物活性離子的持續釋放。利用這種協同效應，PWH支架模仿天然骨的功能，增強血管生成，促進神經元分化，抑制破骨細胞活化，最終增加成骨。與其他支架相比，這些特點使得PWH支架在促進神經血管化骨再生方面具有很強的能力，大鼠顱骨缺損模型支持了這一點。總的來說，這種骨特異性的含有電活性PWH的複合支架為骨化提供了一種綜合有效的策略。
文章來源：https://doi.org/10.1016/j.bioactmat.2022.11.004
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