默克生命科學 | Duolink® PLA熒光實驗方案

Duolink® PLA熒光實驗方案

本實驗方案描述了Duolink® PLA試劑用於組織和細胞樣品中個體蛋白質、蛋白質修飾和蛋白質相互作用的免疫熒光檢測、可視化和定量。如想了解Duolink® PLA技術，請下載我們的手冊並查閱如何優化Duolink® 鄰位連接測定以獲得更多詳細信息。有關其他實驗方案，請參閱Duolink® PLA明場實驗方案和Duolink® PLA Probemaker用戶指南。更多內容請到默克生命科學官網查看：www.sigmaaldrich.cn

材料和設備

Duolink

有關具體的產品建議，請參閱Duolink® PLA產品選擇指南。簡單來說，要運行用於熒光檢測的Duolink® PLP實驗，需要以下Duolink® PLA產品：

1. Duolink® PLA探針（一種PLUS和一種來自不同物種的MINUS，與您的一抗宿主物種相匹配）。每個試劑盒包括：注意：將試劑盒的所有組分存放在4°C溫度下。

   注意：如果需要，可用Duolink® PLAProbemaker PLUS和/或Probemaker MINUS試劑盒生成定製的PLA探針。有關詳細信息，請參閱Probemaker指南。

1. PLA探針（5x）— PLUS和/或MINUS，取決於產品

2. 封閉溶液 — 用於在孵育抗體前封閉樣品

3. 抗體稀釋劑 — 用於稀釋PLA探針，而且如果需要，用於稀釋一抗

2. Duolink® 熒光檢測試劑（可選擇綠色、橙色、紅色和遠紅）。每個試劑盒包括：注意：將所有組分存放在-20°C溫度下。

1. 連接原液（5x） – 稀釋以製備1x連接緩衝液

2. 連接酶 (1 U/μL) – 添加以製備連接溶液

3. 擴增原液 (5x) – 稀釋以製備1x擴增緩衝液

4. 聚合酶 (10 U/μL) - 添加以製備擴增溶液

3. 熒光用洗滌緩衝液（A和B）

4. 含DAPI的Duolink® 封固劑（用於載玻片，儲存在2-8°C）或者核染色和防褪色劑（用於微孔板，儲存在-20°C）

其他材料

1. 檢測目標蛋白質的一抗。當與Duolink® PLA探針一起使用時，必須在小鼠、兔子或山羊中飼養。

2. 高純度純水（無菌過濾，Milli-Q®或類似水質）

3. 載玻片上的樣品（細胞或組織），已經過固定、恢復和透化方面的預處理。關於下列主題的相關建議和詳細信息，請參閱如何優化Duolink®鄰近連接測定：

1. 實驗設計和對照

2. 選擇一抗和優化

3. 樣品處理

設備

1. 熒光顯微鏡，帶有適當的濾鏡、相機和用於圖像採集的軟件

2. 37°C培養箱

3. 搖床

4. 加熱濕度箱或微孔板傳熱座

5. 疏水筆，用於畫出反應區域

6. 冷凍座（用於酶）

7. 染色罐

8. 鑷子

9. 移液器和吸頭（1 μl至1000 μl）

10. 與熒光顯微鏡兼容的蓋玻片

Duolink

以下實驗方案適用於載玻片上的1cm2樣品，需要40 μL溶液以充分覆蓋。根據您的反應面積和樣品數量調整體積。所有孵育均應在濕度箱中進行。所有洗滌步驟均應在室溫下在染色罐中進行，罐中至少有70 ml緩衝液，並輕輕攪拌。

製備試劑

1. 洗滌緩衝液A和B應在開始測定之前製備，將一小袋內容物溶解在高純度純水中，定容1000 mL。溶液可以短時間儲存於室溫下（少於兩周）或者長期儲存於在4℃下。注意：使用前將溶液升溫至室溫。

2. 開始測定之前，用高純度純水以1:100稀釋1x洗滌緩衝液B，製成0.01x洗滌緩衝液B。

3. 許多Duolink® PLA試劑以濃縮原液形式提供，在使用前立即稀釋。請勿儲存稀釋後的Duolink® PLA試劑。

Duolink

在開始之前，將樣品沉積在載玻片上，並經過固定、恢復和/或透化方面的預處理。有關詳情，請參閱如何優化Duolink®鄰近連接測定。

1. 封閉

1. 渦旋Duolink®封閉液。

2. 在每個1cm2樣品上添加1滴（~40 μL）Duolink® 封閉液。確保封閉液要覆蓋整個樣品。

3. 將載玻片置於加熱濕度箱中37℃孵育60分鐘。

2. 孵育一抗在添加抗體之前請勿讓載玻片乾燥，否則會導致背景。

1. 渦旋Duolink®抗體稀釋劑。

2. 在Duolink®抗體稀釋劑中稀釋一抗或抗體至合適濃度。

3. 從載玻片上彈掉Duolink®封閉液

4. 將一抗溶液添加到每個樣品中。

5. 將載玻片置於濕度箱中孵育。用最佳孵育溫度和時間孵育一抗。

3. 孵育Duolink® PLA探針

1. 渦旋PLUS和MINUS PLA探針

2. 在Duolink®抗體稀釋劑中以1:5稀釋PLUS和MINUS PLA探針。對於40 μL反應，取8 μL PLA探針MINUS原液，8 μL PLA探針PLUS原液和24 μL抗體稀釋劑。為所有樣品製備足量的溶液。

3. 從載玻片移除一抗溶液

4. 在室溫下在1x洗滌緩衝液A中洗滌載玻片2x 5分鐘。

5. 移除多餘的洗滌緩衝液，然後塗抹PLA探針溶液。

6. 將載玻片置於預熱的濕度箱37℃孵育1小時。

4. 連接說明：連接酶要等到需要添加到樣品中時立即添加。確保連接緩衝液在使用前完全解凍並充分混合。

1. 用高純度純水以1:5稀釋5x Duolink® 連接緩衝液並混合。對於40 μL反應，將8 μL 5x連接緩衝液添加到32 μL高純度純水中。為所有樣品製備足量的溶液。

2. 從載玻片移除PLA探針溶液。

3. 在室溫下在1x洗滌緩衝液A中洗滌載玻片2x 5分鐘。

4. 在洗滌過程中，使用冷凍座（-20°C）恢復從凍箱里取出的連接酶。

5. 以1:40稀釋度將連接酶添加到步驟（a）中的1x連接緩衝液中，並混合。對於40 μL連接溶液，將1 μL連接酶添加至39 μL的1x連接緩衝液中。

6. 移除多餘的洗滌緩衝液，然後塗抹連接溶液。

7. 將載玻片置於預熱的濕度箱37℃孵育30分鐘。

5. 擴增說明：聚合酶要等到需要添加到樣品中時立即添加。擴增緩衝液對光敏感。避免所有含有擴增緩衝液的溶液受到光照。

1. 用高純度純水將5x擴增緩衝液以1:5稀釋並混合。對於40 μL反應，將8 μL 5x擴增緩衝液添加到32 μL高純度純水中。為所有樣品製備足量的溶液。

2. 從載玻片移除連接溶液。

3. 在室溫下在1x洗滌緩衝液A中洗滌載玻片2x 5分鐘。

4. 在洗滌過程中，使用冷凍座（-20°C）恢復從凍箱里取出的聚合酶。

5. 以1:80稀釋度將聚合酶添加到步驟（a）中的1x擴增緩衝液中，並混合。

6. 移除多餘的洗滌緩衝液，然後塗抹擴增溶液。

7. 將載玻片置於預熱的濕度箱37℃孵育100分鐘。

6. 最終洗滌說明：光敏試劑。始終避免保存載玻片。

1. 從載玻片上移除擴增溶液。

2. 在室溫下在1x洗滌緩衝液B中將載玻片洗滌2x 10分鐘。

3. 在0.01x洗滌緩衝液B中洗滌載玻片1分鐘。

7. 準備成像說明：含DAPI的Duolink®原位封固劑是水性的，不會凝固。可以使用透明指甲油將蓋玻片的邊緣密封到載玻片上。避免蓋玻片下面夾帶氣泡。

1. 從載玻片上移除多餘的洗滌緩衝液。

2. 使用最小體積的含DAPI的Duolink®原位封片劑，用蓋玻片蓋好載玻片。

3. 等待15分鐘，然後在熒光或共聚焦顯微鏡中分析，使用至少20x物鏡。

4. 成像後，可將載玻片在黑暗中4°C下保存最多4天，或者在-20°C下保存最多6個月

結果

圖像採集

Duolink® PLA實驗的結果通常使用熒光顯微鏡觀察，用適當的濾鏡檢測熒光團。Duolink® PLA信號被認為是被研究的細胞的不同位置上的離散熒光點（見圖1A）。單個信號具有亞微米尺寸並且可以在多個焦平面中。因此，可能需要在整個樣品厚度上獲得圖像。然而，只要要比較的所有圖像都來自於樣本內的類似位置，就可以僅在一個平面中獲取圖像。值得注意的是，常在技術陰性對照（例如沒有一抗的對照，參見圖1B）中檢測到一些信號。然而，如果每十個細胞獲得超過一個或兩個信號，則可能需要進一步滴定一抗。

重要的是使用相同的設置（曝光時間、增益、使用的濾鏡等）來捕獲實驗中的所有圖像。可以使用陽性和陰性對照來優化設置。如果PLA信號的數量很大，PLA信號會融合/結合在一起（參見圖2）。這種情況會發生在研究高度表達的蛋白質時，或者過度曝光的圖像捕捉過程中。在設置圖像採集時，必須小心設置，以獲得個體PLA信號。關於如何防止信號融合以及關於其他可能的優化方面，請參閱Duolink® PLA故障排除指南。

圖像分析

現在有幾種圖像分析工具可用於量化PLA信號。可以對圖像數據進行分析得到每個細胞或細胞內每個區域的PLA信號的平均熒光強度和/或PLA信號總數（參見圖3）。報告的定量數據是給定實驗中相對於技術和/或生物對照的數據。然而，只有在PLA信號未融合併且圖像像素未飽和的情況下，才可能進行可靠的量化。

請參閱Duolink® PLA故障排除指南查找故障排除的提示和技巧、一般故障排除說明、以及常見問題解答。

請隨時聯繫我們的技術支持團隊或當地銷售代表以獲得實驗方面的幫助。

定製服務

您的實驗是否需要額外的定製？讓我們為您完成這項工作。請詳細了解我們的定製服務計劃，以加速您的Duolink® PLA項目。