2022年12月23日08:14:12 科學 1132

麻辣燙不要麻醬

一導讀

癌症的基因組分析極大地促進了驅動基因突變的識別和靶向治療的發展。但腫瘤中大多數體細胞突變和拷貝數變異的功能仍不清楚，對靶向治療產生耐藥性的原因和解決耐藥性的方法也缺乏明確的認識。現在基於質譜學的蛋白質組學可以直接檢查出基因組異常的後果，為腫瘤學提供更深入的見解。蛋白質及其翻譯後修飾與基因組、表觀基因組和轉錄組數據的整合構成了蛋白質組學的新領域。下面的這篇綜述描述了蛋白質組學的最新發展以及如何利用蛋白質組學研究癌症。

二背景知識

癌症蛋白質組學主要的內容是將基於質譜儀(MS)的蛋白質丰度測量和翻譯後修飾(PTMs)與來自臨床癌症模型和腫瘤樣本的基因組、表觀基因組和轉錄組數據相結合。癌症蛋白質組學中多組數據的分析給人們帶來了新的生物學知識，提高了我們對惡性腫瘤和治療的理解。基因組學和表觀基因組學為可能發生的事情提供了細胞藍圖，而蛋白質組學則為已經發生的事情提供決策，因為蛋白質及其修飾是生物表型的最終仲裁者。

這些年來，有許多研究已經確定了驅動因子（EGFR、ERBB2(也稱為HER2)、BCR-ABL、ALK和BRAF）會影響轉移性乳腺癌、慢性粒細胞白血病、非小細胞肺癌和黑色素瘤等癌症的靶向治療。然而，絕大多數體細胞突變是沒有特定致癌功能的乘客突變。目前區分驅動和乘客突變仍然是一個難題，科研人員一般依賴於重複出現的統計數據來判斷一個基因是否是驅動基因。但是，在單個腫瘤中，反覆出現的點突變、小插入或小缺失的數量很少，那些不經常出現的突變基因不容易發現或不容易被藥物治療，這會限制了靶向治療的發展。染色體拷貝數的擴增或缺失會影響多個基因，但目前對這些改變的後果知之甚少，也很難建立相關的模型。由於癌細胞有能力為細胞的生存和生長尋找替代途徑，所以科研人員頻繁的對靶向治療的耐藥性進行研究。最近，免疫腫瘤學方法認為癌症基因組和免疫系統之間的相互作用至關重要。蛋白質基因組學在這方面也提供了新的視角。

典型的蛋白質組學數據

蛋白質組學技術，主要基於液-質聯用聯用技術(LC-MS/MS)，廣泛地應用於癌症研究。如下圖所示顯示了當前技術（臨床數據；WGS，全基因組測序；WXS，全外顯子組測序；甲基化芯片；RNA-seq，RNA測序；miRNA測序）測量的預期特徵數量(拷貝數變異(CNA)、DNA甲基化)。通常，人們將來自腫瘤組織樣本的數據與正常鄰近組織(NAT)樣本進行比較，在這一過程中，科研人員會利用各種數據類型進行分析。翻譯後修飾(PTMs)數據是通過對富集樣品進行深度LC-MS分析生成的，這樣可以實現更高的檢測靈敏度。現在對腫瘤樣本的深層次分析通常使用多重的等壓化學標記試劑（TMTPro，能夠實現多達18個樣本）。

最近還出現一種的微創方法：可以從單針穿刺活檢中進行DNA、RNA和蛋白質組分析。科研人員使用新的樣品製備方法，即在FFPE樣品（組織樣本利用福爾馬林固定、石蠟包埋形成的石蠟切片或者石蠟塊樣本，是醫學領域常見的生物材料）中完成全蛋白質組分析，但由於包埋過程本身的影響，PTMs分析仍存在局限性。此外，科研人員還在繼續開發各種方法，比如FAIMS、SPS-MS3和實時數據分析，以提高蛋白質組測量的深度、準確性和重複性。最後，Data Independent Acquisition（DAI）已經開始應用於多組學和蛋白質基因組學研究，該技術可以減少蛋白質組數據中跨樣本和數據集中的缺失值（圖1）。

圖1 典型的蛋白質組學數據

使用雲計算模式分析蛋白質組的數據

雲計算（Cloud computing）模式是人們按照自己的需求訪問共享計算資源，這些資源可以快速配置以供使用，並且可以在數據分析後發表。隨着科學家們的深入研究，數據集的規模越來越大，越來越多的算法被用於分析這些數據。雲計算是分佈式計算的一種，指的是通過網絡「雲」將巨大的數據計算處理程序分解成無數個小程序，然後，通過多部服務器組成的系統進行處理和分析這些小程序得到結果並返回給用戶。雲計算早期，簡單地說，就是簡單的分佈式計算，解決任務分發，並進行計算結果的合併。因而，雲計算又稱為網格計算。通過這項技術，可以在很短的時間內（幾秒鐘）完成對數以萬計的數據的處理，從而達到強大的網絡服務。美國國立衛生研究院(NIH)數據共享計劃是一項基於「雲」的計劃，旨共享基因組和蛋白質組數據。國家癌症研究所(NCI)基因組學雲試點已經創建了基於雲的共享計算環境。Terra 雲平台可以快速分析海量的醫療數據。利用Terra的基礎設施，科學家們已經開發了如PANOPLY這樣的平台來自動分析蛋白質基因組數據。利用這些平台我們可以快速分析蛋白質基因組，從而提出相關的疾病假說，這些假說可以通過其他分析和實驗室實驗進一步探索（圖2）。

圖2 通過雲計算進行蛋白質組數據分析

癌症中蛋白質組學格局

這些年來針對不同癌症類型，科研人員發表了一系列蛋白質基因組的研究。這些研究系統地整合併分析了基因組、轉錄組、全蛋白質組和PTMs數據，這樣就可以進一步從生物學角度深入了解疾病的發病機制，並確定每種癌症類型的治療靶點。總之，科研人員已建立了常用的統計方法來提煉癌症亞型，探索免疫微環境，推斷新的抗原譜，探索DNA、RNA、蛋白質和PTM水平的協調調控作用以及蛋白質組或PTM特異性調控作用，最終可以確定癌症驅動因素和治療靶點。以下是這些已發表的關於癌症的蛋白質基因組學研究 (表1)。

表1 蛋白質基因組研究的概念見解

蛋白質組學計算方法和工具

一般處理原始基因組數據的目的是為了識別體細胞和生殖系細胞的突變、量化拷貝數偏差和轉錄組分譜分析。所以計算工具一般需要具有的功能有：讀取各種不同成分、質量控制、變體識別和RNA定。例如基因組分析工具包（GATK ，The Genome Analysis Toolkit）是由Broad Institute 開發的一套能發現多樣性位點的工具集，它主要是為了分析DNA 測序和RNA 測序數據中的SNP（Single Nucleotide Polymorphisms）和indel（insert&delete）。現在科研人員最常用的是LC-MS/MS即液相色譜串聯質譜技術，用於混合物的分離純化和定性定量鑒定。分析原始LC-MS/MS蛋白質組數據可以產生定性和定量的蛋白質、磷酸化位點、乙酰位點和泛素化位點，這些分析工具有MS-GF+、Spectrum Mill、MaxQuant、MSFragger、Philosopher、CDAP。蛋白質組學中存在一個特殊的問題：由於多肽採樣具有隨機性、RNA-seq測量的動態範圍有限性而導致的數據矩陣中出現更大程度的缺失值。這種現象在PTMs數據集中尤其明顯。科研人員已經提出各種蛋白質組數據的imputation策略，想從計算方式上解決這一問題。例如DIA，可以緩解丟失數據的問題。下圖中精選出了常用的蛋白質組學計算工具（圖3）。

圖3 蛋白質組學的分析工具

蛋白質組學相關的科研思路

蛋白質組學（Proteomics）是蛋白質與基因組學兩個詞的組合體，表示「一種基因組所表達的全套蛋白質」是一門以全面的蛋白質性質研究為基礎，在蛋白質水平對疾病機理、細胞模式、功能聯繫等方面進行探索的科學。近年來，隨着蛋白質組學技術突飛猛進的發展，已經應用於生命科學研究的各個方面。那麼如何利用蛋白質組學技術進行科學研究。

①蛋白質組學確定新的潛在治療靶點

科學家們發現早髮型癌症的發病率，從1990年開始在世界範圍內急劇上升，全球迫切需要開發治療癌症的療法。腫瘤已經成為了我們日常生活中的常見病，隨着醫學技術及科技的發展，臨床對於惡性腫瘤的治療，已經不再局限於手術、放療、化療三種手段來了，分子靶向治療、免疫治療等越來越多的新方法應用於臨床，且效果很好，極大地提高了臨床治療腫瘤的成功率，延長了腫瘤患者的生命及生存質量。蛋白質組學分析，能夠在高時間分辨率下確定轉錄組和蛋白質組的變化，加速確證致病性相關的生物途徑以及尋找潛在的藥物靶標。

下文的文章1對871名CLL（慢性淋巴細胞白血病）和MSBL（瀰漫性大B細胞淋巴瘤）患者的384種總蛋白質和翻譯後修飾蛋白質的表達進行了評估，並與臨床數據相結合，目的是為了改進診斷和治療的策略。這項研究是迄今為止規模最大的CLL蛋白質組學研究。該研究確定了複發癌症中的蛋白表達特徵(SG)，對CLL進行了分類並確定了一個新的子集。這些特徵對首次治療的時間(TTFT)、總生存期(OS)有很強的預測作用。作者還發現了一種新的具有毛狀細胞白血病樣蛋白質組學特徵但治療反應差的SG。蛋白表達特徵可以取代了其他預後 (如Rai分期、IGHV狀態)，並且對現代治療(如BTK抑製劑)的反應有預測作用。SGs和PFGs的加入為疾病提供了新的藥物靶點，並確定了「Watch & Wait」（觀察並等待策略是指患者通過接受密切隨訪、監測，避免或者延遲更為積極治療的策略，而狹義上的觀察等待限於新輔助治療後是否進行手術）與早期干預的最佳候選標誌物。總之，蛋白質組學在改善癌症分類、治療策略選擇和識別新的治療靶點方面具有廣闊的前景（圖4）。

圖4 CLL的潛在治療靶點

②選擇治療和預後的生物標誌物

生物標誌物對於準確的臨床評估至關重要，其中包括疾病診斷，預後和最佳治療干預的選擇。癌症是全球非傳染性疾病死亡的第二大原因，目前大多數生物標誌物研究都集中在癌症上。生物標誌物不僅可以是分子特徵，還可以是組織學、放射學或者生理學特徵。常見的生物標誌基於臨床癥狀、體征、生理和實驗室檢測結果，其中組織學、放射學和磁共振成像生物標誌依賴於醫生的主觀解釋標誌物組的檢測準確性要遠遠高於某一個或某幾個蛋白，越來越多研究的重點從單個生物標誌物轉移到生物標誌物組，甚至與現有的臨床指標進行整合。高通量蛋白質質譜技術基於臨床樣本產生的大數據集，可以作為重新挖掘生物標誌物的豐富資源。

乳腺癌是女性最常見癌症之一，男性和女性都有可能罹患乳腺癌，但女性的發病率遠遠高於男性。儘管在乳腺癌的基因組分類方面取得了進展，顯着地提高了診療水平，但目前的臨床檢驗測試和治療決策通常還是基於蛋白質水平的信息。下文2的作者對300 例確診患者的臨床存檔的FFPE 乳腺癌手術標本（每種 PAM50 亞型中的 75 例）進行了全面的蛋白質組學分析，總共量化了 4214 種蛋白質，並以臨床適用的方式表徵了乳腺癌的異質性。研究人員發現了免疫差異、ECM 和脂質代謝通路可能與臨床相關。在侵襲性 PAM50 分類的基底樣癌中，蛋白質組學分析發現其中一組具有免疫「熱」表達特徵和最佳的生存期。在 88 例三陰性乳腺癌中，四個蛋白質組群顯示出基底免疫「熱」、基底免疫「冷」、間充質樣和管腔樣的特徵，並具有不同的生存結果。蛋白質組學分析確定了潛在的生物標誌物和治療靶點：抗原提呈蛋白TAP1和HLADQA1的聯合表達與患者生存相關，作者的研究還為臨床乳腺癌分類提供了資源（圖5）。

圖5 FFPE乳腺癌組織標本的蛋白質組學分析

③用多組學方法重新定義和表徵癌症亞型

現代腫瘤學認為腫瘤不再是一種疾病，而是一類疾病。對於同一種癌症類型（以癌灶器官命名）而言，由於腫瘤發病機制的複雜，在組織病理學及分子生物學上都具有高度異質性。

腫瘤通常是多基因參與的複雜疾病，不同階段具有不同基因表達譜，癌症的遺傳性、個體差異性和分子機制的複雜性，因此需要由基因群或基因簇來描述其特徵。癌症亞型主要是通過臨床、基因組或轉錄特徵來定義的。多組學方法能夠根據潛在的生物學和/或結果對亞型進行進一步的提煉或重新定義。癌症中這種更精細的亞型分型有助於我們定製治療策略和評估療效。比如是乳腺癌，具有lumA,lumB,basal,HER2 等亞型，其中TNBC（三陰性乳腺癌）可以繼續細分為3~7種亞型，當然，現在有了蛋白質組學的加持，細胞亞型會越來越清晰。如果要整合多組學數據，分類也會更加複雜。

肺腺癌（LUAD）的基因組研究提高了我們對該疾病生物學和加速靶向治療的理解。但是，LUAD的蛋白質組學特性仍然知之甚少。下面這篇文章3對103例中國患者的LUAD進行了全面的蛋白質組學分析。蛋白質組學，磷酸化蛋白質組學，轉錄組和全外顯子組測序數據的綜合分析顯示了癌症相關的特徵，例如腫瘤相關的蛋白質變體，獨特的蛋白質組學特徵以及早期患者或具有EGFR和TP53突變的患者的臨床結局。基於蛋白質組的LUAD分層顯示了與不同的臨床和分子特徵相關的三種亞型（S-I，S-II和S-III）。此外，作者提出了潛在的藥物靶標並驗證了HSP90β的血漿蛋白水平是LUAD的潛在預後生物標誌物。這項研究的綜合蛋白質組學分析可以更全面地了解LUAD的分子結構，並為更精確的診斷和治療提供機會（圖6）。