1 股骨頭壞死病因：
股骨頭壞死是局部血運不良，供給股骨頭的動脈血液出現循環障礙，從而使得股骨頭內需要的血液不足，進一步壞死，骨密度降低，股骨頭容易發生塌陷的一種病變。最早的骨壞死相關報道是Alexander Munro在1738年發表的，直至1957年，有國外學者報道了第一例與激素相關的骨壞死。目前股骨頭壞死的發生在任何年齡段都有可能出現，平均年齡低於50歲，大部分都是雙側壞死[4]。近些年激素類藥物在臨床上應用於各種急慢性疾病的治療，如系統性紅斑狼瘡、類風濕性關節炎、脊髓損傷等，但是大劑量或長期使用激素類藥物會導致一系列嚴重的併發症，如股骨頭壞死、庫欣綜合征、誘發或加重感染等[5]。根據流行病學研究，非創傷股骨頭壞死患者達812萬，男性患病明顯高於女性，北方患病率高於南方，城鎮居民高於農村，激素在臨床上廣泛的使用勢必會存在其潛在的危險，有學者表明激素性股骨頭壞死已佔據了非創傷性股骨頭壞死的首位[6]。在中國非創傷性股骨頭壞死主要病因是皮質類固醇藥物的使用、長期酗酒、減壓病、血紅蛋白病；吸煙、懷孕、放射治療也增加股骨頭壞死風險[7]。
2 股骨頭壞死的發病機制：
大多數醫家對股骨頭壞死的發病機制眾說紛紜，到目前為止也尚不明確，有人認為股骨頭壞死是有遺傳易感性代謝因素和血液供應的局部因素(包括血管損傷、骨內壓力增高和機械應力共同作用所致)，有研究報告稱長期使用激素類藥物導致股骨頭壞死與藥物持續的時間和劑量大小關係密切。主要是激素容易導致脂肪栓塞，並使得血液處於高凝狀態，引起血管炎，激素導致的骨質疏鬆使得骨質的強度下降，承重力量消失，所以容易出現塌陷[8]。目前學者所認同的機制有骨質疏鬆、骨內壓增高、血管內凝血等。由於患者長期使用激素，發生骨質疏鬆，易於受到壓力出現骨小梁的細微骨折，由於累積的損傷較多，對機械抗力下降，從而出現塌陷，骨髓細胞和血管受壓股骨頭因缺血發生壞死。激素的使用能夠使髓內脂肪體積增多，從而導致微血管脂肪栓塞和骨細胞脂肪沉積，骨髓細胞被大量脂肪細胞所佔據，脂肪細胞融合成碎片造成骨髓衍生細胞死亡並且髓內腔空間壓力增大，組織缺氧、水腫，血液滲出，加重微循環障礙，供養股骨頭的血液減少，最終導致股骨頭壞死。長期服用大量的激素，使得激素在人體內大量堆積，導致患者體內的血液變得黏稠，出現高凝血、低纖溶的狀態，並且局部的凝血活性增高，形成微血栓局部血管閉塞，導致支配區域股骨頭壞死[9]。
3 股骨頭壞死骨組織病理學改變：
股骨頭壞死動物模型製備從病理學角度分為早、中、晚3期(見表1)。而創傷性股骨頭壞死在初期就出現動、靜脈血運受阻，磁共振檢查時可見明顯改變[10]。
4 股骨頭壞死影像學
在建立動物模型時影像學的檢查方法必不可少，通過影像學檢查等評價動物造模是否成功。目前檢查方法主要有 X 射線平片、CT及MRI[11-12](見表2)。臨床上針對股骨頭壞死使用Ficat分期，主要分4期：1期有臨床癥狀，磁共振可見信號強度改變，骨髓水腫；2期X射線片已有骨密度降低、囊性變、骨硬化等表現，但股骨頭形態正常；3期可見股骨頭塌陷，但關節間隙保持正常；4期可見關節間隙狹窄，髖臼出現異常改變。早期股骨頭內部組織細胞形態尚未發生明顯改變，故X射線片對股骨頭缺血性壞死的早期診斷意義不大，晚期X射線片可見股骨頭因塌陷失去原有球面結構，以及發生退行性關節炎的表現[12]。CT檢查能夠顯示微細的松質骨和皮質骨的破壞，對於解剖結構或相互重疊的區域可明確其解剖關係及其異常，對於病變的內部結構的顯示比普通X射線片更加準確。CT的密度分辨力優於X射線片，在一定程度可以區分不同性質的軟組織。在顯微CT分析中，在測骨礦物密度時具有明顯優勢，這也是預測骨折危險的依據。顯微CT能夠在任意方向測定骨三維結構，具有連續性和完整性的優勢，還能夠全面、立體、實時觀察骨質量的改變，評價骨體積分數、骨小梁間隙等，因此顯微CT的三維重建分析方法較傳統方法更為全面[15]。
5 股骨頭壞死動物模型選擇
建立動物模型後是希望能夠較完整地模擬出人類股骨頭缺血性壞死從早期到晚期病理、生理改變並且壞死區域與人類股骨頭缺血性壞死位置相似，目前主要還是使用一些比較成熟的建模方法，缺少一種理想的動物模型來高度模擬臨床上股骨頭缺血性壞死的病變過程，所以還需要不斷完善和改進。目前作為常用的造模動物的選擇四足動物有狗、兔、大鼠、豬；兩足動物有雞和鴯鶓[16]。
構建實驗動物模型應該以臨床現狀為前提，從而做出滿意的實驗數據，首先選擇實驗動物的生理結構和組織學特點應該力求可靠地反映人類疾病，其在進化上應該與人類有良好的親緣性及相似性，疾病在人類身上的進展過程在動物模型當中也需要體現，到晚期動物模型股骨頭會出現塌陷變形，即股骨頭骨壞死應該發生在關節軟骨區域，還要保證股骨頭的大小及結構應當與生物力學相聯繫，一般選用的大多都為四肢動物，所以在構建模型要考慮四肢負重的情況。王海洋等[17]採用股骨頸中部垂直截骨和螺釘內固定，選擇影像學X射線片製備犬單側股骨頸骨折內固定模型。鞏建寶等[18]通過磁共振的精確定位，使用一種微創低溫冷凍設備(氬氦刀)建立犬股骨頭缺血性壞死模型，該方法具有創口小、壞死部分易於控制、動物死亡風險下降、造模成功率高、可重複操作性強、利於標準化研究等特點，為股骨頭壞死的治療方式醫學發展提供了經驗。顧江江等[19]採用酒精灼燒青腳麻雞製備股骨頭壞死模型，採用空心電鑽在股骨頭上鑽孔，將酒精棉球填塞鑽孔內，保證松質骨和酒精的充分接觸，觀察1個月X射線片顯示關節面出現塌陷。曲春濤等[20]採用液氮冷凍3個循環之後採用射頻加熱製備鴯鶓股骨頭壞死動物模型，除了2隻死亡和4隻感染，其餘6周後可見股骨出現水腫現象，12周後股骨頭形態明顯改變及關節間隙改變，16周部分鴯鶓出現股骨頭塌陷合併骨壞死晚期表現。
雙足類動物特點是和人類的負重方式相似，選取該動物主要是研究股骨頭缺血性壞死病程中生物力學因素。鴯鶓股骨頭壞死模型是最好的動物股骨頭壞死模型，雖然鴯鶓來源稀少，不好獲取，餵養有難度，但是鴯鶓為一種雙足負重，身高、體質量及股骨頭受力情況均與人類類似的動物，股骨頭應力分佈與人類髖關節的測量數據相類似；且受力為沿股骨幹的方向，均與人類相似，這種雙足類動物與四足動物的髖關節生物力學的差異是造成不同股骨頭是否塌陷的關鍵性因素[21]。實驗中採用青腳麻雞相較於其他除了具備易獲得、容易飼養、死亡率低的特點，股骨頭較大，方便手術和術後觀察且為雙足類動物，並長期處於站立位，股骨頭受到的機械應力與人體的生物力學相似，能更好地模擬人在負重情況下的股骨頭壞死和修復的表現。兔子是激素性股骨頭壞死最常用的動物模型，雖然具備成本低、飼養簡單等優點，而且股骨頭相比大鼠來說更大一些，易於觀察和取材；但是造模周期較長，成模率不高[22]。
犬為四足動物，雖然選用其造模，其生物力學承重區域與人類不相符合，不能完全模擬出人類股骨頭壞死的特點，但它的解剖及組織結構與人類很相似，體型大小合適、來源獲取方便，所以製備中應用最為廣泛[23]，可用於股骨頭缺血性壞死各種保頭手術治療，為後期造模成功後的治療提供更理想的模型[24]。
6 股骨頭壞死動物模型製備方法的選擇
動物模型的製備方法有很多，主要分為創傷性和非創傷性，創傷性包括手術創傷造模、手術血運阻斷法、化學損傷造模法、無水乙醇造模、液氮冷凍造模等；非創傷性主要包括單純激素造模、激素聯合脂多糖、激素聯合馬血清等方法[25-26]。
創傷是股骨頭壞死的常見病因，有學者希望通過手術創傷造模來研究股骨頭壞死。手術造模主要是使得股骨頭的血液供應受到阻礙，供給股骨頭的血液主要來源於旋股內外側動脈、股骨頭圓韌帶動脈，股骨幹滋養動脈[27]。旋股內側動脈多於股三角處發於股深動脈，少數起始於股動脈，旋股內側動脈從股深動脈發出後，走內側於髂腰肌內側緣處分為兩支，深支較粗，行於恥骨肌與髂腰肌兩條肌肉之間的後方，旁支供養附近的肌肉，終支於股方肌深面至轉子窩，越過閉孔外肌，供應股骨頸基底部，延續為外側頸升動脈。旋股外側動脈大多也發於股深動脈，與旋股內側動脈相比，起於股深動脈處下方，直徑稍粗，向外側走行，從縫匠肌和股直肌之間的肌間隙穿出，之後分為升降兩支，升支向外側走行於股外側肌的深部，最後股骨頸的基底部的外側面有一些細小分支，與旋股內側動脈的分支共同構成囊外動脈環。囊外動脈環上又發出的分支分佈到髖關節囊的關節囊支，之後進入骨內滋養股骨幹，以及沿股骨頸上行營養股骨頭、股骨頸的頸升動脈。由閉孔動脈發出的、小部分來自於旋股內側動脈稱為股骨頭圓韌帶動脈、股骨頭骺內側動脈。模擬臨床上股骨頸骨折及脫位等原因引起的股骨頭靜脈淤滯、動脈血供受損及中斷導致的骨壞死、股骨頭結構發生改變。
6.1 股骨頭韌帶結紮 股骨頸骨折會影響髖關節的血運，造成周圍的血管損傷，從而影響對股骨頭的血供。一般發生骨折會伴隨着移位，血流動力學發生改變，最終出現股骨頭壞死。另外髖關節內的滲血或者出血，關節囊內壓力進一步增高，股骨頭內部結構造成了血液缺失，增加了肌肉組織通透性，水腫發生在局部，最終導致股骨頭缺血性壞死[28]。王俊鋒[29]採用股骨頭韌帶結紮觀察兔股骨頭結構的形態學變化，手術組在兔下腹部作垂直切口，將皮膚一層一層打開，從肌間隙撥開，打開髖關節囊，用手將股骨採用旋外位，結紮股骨頭韌帶，並使旋外時導致股骨頭脫位後複位，之後縫合關節囊，將每一層肌肉、筋膜進行縫合；對照組只打開關節囊，將股骨頭韌帶找到，不進行結紮，直接關閉縫合關節囊，逐層縫合。術後4周在光鏡下檢查骨形態發生蛋白7 在軟骨下的肥大軟骨細胞的表達呈現明顯增強的現象，這說明在結紮後，股骨頭韌帶周圍的關節面血液受到阻礙，發生改變；軟骨關節面的軟骨細胞及軟骨下細胞生長增殖受到抑制，甚至發生壞死；骨形態發生蛋白7 的表達增強，表明其對軟骨細胞發揮積極的修復作用。通過結紮的方法成功製備了動物模型，這對臨床上創傷性股骨頭缺血性壞死的治療研究有一定幫助。
6.2 酒精造模 主要是通過在股骨頭局部注射無水乙醇，導致股骨頭缺血性壞死，進而壞死骨質吸收，骨小梁強度下降，髖關節持續生物壓力阻礙骨壞死後的修復作用，引起骨小梁力學強度進一步下降，使動物模型容易進展至股骨頭塌陷。該類動物模型常用於股骨頭缺血性壞死治療方法的研究。自 1922 年 Axhausen 報道乙醇中毒患者易患骨壞死疾病以來，人們一直在探討研究酒精和股骨頭壞死發病之間的關係，研究其機制、病理過程等。在非創傷性股骨頭壞死的致病因素當中，酒精導致的股骨頭壞死是僅次於激素相關的第二大因素，長期飲酒導致股骨頭壞死病例在臨床中十分多見並且好發於聚會比較的多的中青年人，一旦發病，雙側股骨頭均有癥狀且影像學也有變化，病變發展到3期至4期股骨頭表面結構出現變形塌陷及不可逆性骨性關節炎，患者的生活自理能力失去，最後只能採用人工髖關節置換手術治療。楊雲等[30]採用乙醇製備酒精性股骨頭壞死大鼠模型，實驗中除有6隻大鼠死亡，餘下良好，觀察4個月股骨頭軟骨出現顏色晦暗，失去原有的潤澤，部分血管彈力纖維減少，彈性纖維增生，微血栓數量增加；6個月後出現股骨頭表面結構出現破壞，甚至脫落，骨質量下降，未見股骨頭明顯變形塌陷及髖臼磨損改變。針對大鼠四肢負重，後肢的負重量小，所以將食物及水放到高處以便大鼠進食水時會增加雙下肢承重量，這種方式的採用會更加近似人類的生物力學特性。因此研究酒精性股骨頭壞死發病機制需要考慮多種因素對其實驗過程中造成的影響，在造模過程中借鑒生物力學原理，使壞死程度發展與人類股骨頭髮生病理現象類似，這將是未來股骨頭壞死動物模型研究的主要發展方向[31]。
6.3 液氮冷凍法 相對來說是應用比較多的一種造模方法，該方法建模周期短、成功率高、可重複性好。從髖關節後外側切口充分暴露施術部位，切斷股骨頭內的圓韌帶，並用三層無菌紗布保護周圍組織防止損傷，然後將液氮浸泡在股骨頭當中，冷凍一次復溫數次，這種操作對股骨頭局部進行液氮冷凍之後，骨內周圍組織細胞溫度迅速下降而出現休克，引起股骨頭內部分血管發生痙攣，毛細血管內皮細胞水分丟失，細胞皺縮，微血栓形成，另外冷凍後可引起毛細血管通透性增加，導致血液黏稠度增加，血流速度緩慢。造模採用液氮低溫冷凍一次復溫數次循環，可以使其骨內部分細胞、骨內細胞結構蛋白質和細胞骨架蛋白破壞，進一步阻斷了 DNA複製，使得股骨頭內部活性成分出現壞死。周正麗[32]採用液氮製備兔股骨頭壞死模型，在無菌條件下進行，以雙側大轉子為連線，做一弧形皮膚橫切口，剝離淺筋膜和深筋膜，充分暴露肌肉組織，切斷股骨頭圓韌帶，使股骨頭處於全脫位狀態，暴露股骨頭關節面，固定橡皮漏斗，液氮冷凍股骨頭，術後4周關節面才出現不完整，開始剝脫，術後6周有缺損，觀察8周後股骨頭出現明顯塌陷。該方法是目前這些造模方法中最有效、成功率最高的導致股骨頭壞死的方法；並且採用液氮冷凍能夠更好地模擬人類股骨頭壞死病理生理過程中壞死區域的骨修復，實驗的可重複性很高，能夠控制其冷凍的範圍和時間，是一種方便可操控的標準化動物模型。
6.4 激素造模 成骨分化與成脂分化之間的不平衡是激素性股骨頭壞死的主要原因。有研究發現類固醇激素能夠降低Ⅰ型膠原及骨鈣素 mRNA 的表達，骨髓遭脂質代謝紊亂的侵襲，使得骨祖細胞死亡加快，損傷修復緩慢[33]。長期大劑量服用激素類藥物，會引起血脂增高、血液流速緩慢，容易全身形成脂肪栓塞，供應股骨頭的血液來源局部出現血瘀，股骨頭壞死脂肪細胞的形成會造成骨髓造血細胞的死亡，最終導致股骨頭壞死。長期大劑量使用激素會導致患者體內脂代謝紊亂、血液黏稠度增高、骨細胞脂肪蓄積及脂肪變性，這些原因使得血液流速減慢，通往骨細胞的血液量減少甚至出現血液凝固，骨髓腔受到壓力，股骨頭中的微小血管出現阻塞現象，最終導致缺血性骨壞死。糖皮質激素的使用會直接降低蛋白質的合成，阻礙機體對鈣的吸收，大量鈣流失，骨質量明顯降低，出現骨質疏鬆。另一方面成年人的成骨細胞修復機體的速度大致和破骨細胞相一致，大劑量的糖皮質激素使得成骨細胞修復速度減慢，減少骨轉換，骨質量下降，容易導致股骨頭的承重部分出現塌陷，甚至壞死[34]。服用糖皮質激素後，成骨細胞和骨細胞最易受到侵害，骨細胞的凋亡會使骨密度降低、骨小梁紊亂，此時受到外傷情況股骨頭部位發生骨折，最後股骨頭缺血性壞死形成。佟鵬等[35]根據現代研究構建的動物模型方法採用醋酸潑尼松龍聯合馬血清建立動物模型，實驗當中考慮人類生物力學的特性，給兔子飲水採用懸吊法，保持下肢直立，結果有8隻兔子造模成功，軟骨結構改變，軟骨塌陷嚴重。
綜上，通過手術方式建立股骨頭壞死模型存在一定的弊端，手術創面大、對動物組織損傷大、死亡率較高、病理改變與人類病理過程有差別。乙醇製備股骨頭壞死，造模成功率低下，乙醇的用量和造模過程能否精準的作用於股骨頭，難以進展到後期。液氮冷凍造模操作時對其他組織破壞程度難以把握，冷凍範圍不能確定，另外動物的恢復能力強，能否成功造模還是未知數；其致病因素與人類股骨頭壞死無相關性，不太適合於對股骨頭壞死病因、發生機制和特徵的研究。相比較其他而言，激素製備創傷小、方便操作，對股骨頭壞死病理過程的研究更加適合，並且激素聯合馬血清、激素聯合脂多糖造模成功率更高[36]。
近年來因為激素的使用而發生的股骨頭壞死率增高，所以探索一種貼近人類股骨頭壞死病理變化的動物模型為臨床提供有效的治療手段必不可少。由於激素在動物和人體中有相似的作用機制[37]，於是人們開始採用激素製備動物模型。目前關於激素性股骨頭壞死動物造模的方法有很多，例如單純使用激素法、激素聯合馬血清法、激素聯合內毒素法等，進行實驗給予動物的藥物劑量和方式有所不同。
(1)單純激素誘導：劉偉等[38]單純應用低劑量激素製備兔股骨頭壞死模型，採用直立進食水方式增加股骨頭負重，根據組織病理學檢查將甲潑尼龍琥珀酸鈉肌肉注射，給葯後4周脂肪細胞體積增大，胞核消失，部分崩解破裂，骨髓幹細胞相對減少。6周可見骨小梁內的空骨陷窩數量逐漸增多。8周可見部分股骨頭軟骨區形成壞死，並可見壞死和軟骨面塌陷，雖然出現1隻兔子死亡，但建模方式比較安全，可以保證實驗最終的樣本例數。該方法成功率高、病理變化符合、成本低、操作方便，避免不必要的因素影響，有利於臨床醫學股骨頭壞死的病機探索研究。
(2)激素聯合馬血清誘導：曹良權等[39]採用不同劑量的馬血清和激素製備兔股骨頭壞死，分成4組，採用磁共振及進行觀察，其中有2隻死亡。高劑量組在第2周就出現異常信號，在第4周表現為斑片狀或是小結節狀高信號影，在第6周高劑量組80%出現骨壞死信號；其餘組出現骨壞死的比率均低，組織病理學，空骨陷窩程度在高劑量地塞米松聯合高劑量馬血清組逐漸增加，一些骨小梁已破損不完整。糖皮質激素已被認為是非創傷性股骨頭壞死的最常見原因。該實驗調整馬血清和激素注射的劑量和時間，從而避免因注射過量及間隔時間過短而引起過度的免疫反應致動物死亡，且具有較高的成功率和類似的安全性；採用血液學進行評估觀察30 d檢測模兔子的血清膽固醇和三酰甘油水平，各組均增高，尤其高劑量組血清膽固醇水平明顯升高。
(3)激素聯合脂多糖誘導：採用激素聯合脂多糖造模，具備造模時間減少、動物死亡風險降低、造模成功率高的優點，因此，多用於股骨頭壞死病理機制方面的研究。喻鈞倫等[40]以螺旋CT掃描、Micro-CT掃描、蘇木精-伊紅染色方法觀察兔股骨頭形態及骨質密度等影像學表現，觀察骨小梁的形態、分佈、骨皮質厚度，並測定骨礦物質密度等，分別在建模後第5，10，15，20天觀察股骨頭內部結構及密度改變，其餘形態未發生變化。顯微CT表明骨小梁紊亂，骨質量下降，股骨頭可見細小微型骨折。病理學檢查骨細胞凋亡增多，骨質量丟失增加，承重力量消失，骨修復出現障礙。田力等[15]使用地塞米松聯合脂多糖製備股骨頭壞死，採用螺旋CT、顯微CT、組織形態學檢查，將股骨頭壞死兔和正常兔對比，螺旋CT示：骨密度不均一，關節面模糊；顯微CT示：骨礦物質含量及骨小梁密度均降低；組織形態學示：髓腔內造血細胞明顯減少，軟骨下骨微小血管內可見血栓形成。實驗當中使用了CT、顯微CT掃描和病理學檢查來評價早期股骨頭缺血性壞死，3種方法相互補充，相互聯繫，診斷明確，具有客觀性，CT掃描方便快捷，能夠觀察股骨頭不同橫斷面密度的變化，判斷是否造模成功。
綜上所述，沒有一個動物模型能和人類疾病發生的病理機制相同，動物模型的製備時間、制模成功率、制模成本均對實驗有影響。不同的動物在不同的模型建立上有各自的優勢，物理方法造模雖然能降低造模死亡率、造模周期短，但不符合臨床的疾病的病理過程；化學方法造模容易在動物體內殘留化學物質，對後期研究影響較大[42]。激素性股骨頭壞死動物模型在病因學上具有與臨床股骨頭壞死患者貼近，是目前常用的建模方法之一，該方法不需要手術，操作簡單，但也存在一些問題，激素的種類包括很多，每種激素的對其產生的影響，作用靶點是否一致，另外激素的使用劑量、使用次數、產生作用的時間以及作用部位能否集中在股骨頭上，仍需要進一步探討和研究。相信隨着社會發展，研究的不斷深入，更好的動物模型將會建立，這也是未來幾年國內外學者共同追求的目標和前進的方向。
信息來源：中國組織工程研究，2021，25(29):4691-4696.
