2023年05月12日23:32:21 熱門 1384

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液相色譜（Liquid chromatography 簡稱LC）是利用混合物在液-固或不互溶的兩種液體之間分配比的差異，對混合物進行先分離，而後分析鑒定的儀器。

今天小譜就其發展史、檢測原理、結構等和大家進行探討，一文把液相色譜儀講通透。

（如果讀完文章您覺得還有哪些想聽的知識點小譜沒有講到，亦或是覺得小譜文章中有哪些觀點您不太認同，歡迎您積極留言。)

「液相色譜儀」的誕生和發展

早在古羅馬時期，人們就已經知道將一滴包含混合色素的溶液滴在一塊布或一片紙上，通過觀察溶液展開的同心圓環來分析染料和色素。這就是最古老的液相色譜分離技術。

二十世紀初期，俄國植物學家茨維特（Tsweet）在1906年發表的關於色譜的論文中寫到：將一植物色素的石油醚溶液從一根主要裝有碳酸鈣吸附劑的玻璃管上端加入，沿管濾下，然後用純石油醚淋洗，結果按照不同色素的吸附順序在管內觀察到它們相應的色帶，他把這些色帶稱之為「色譜圖」（Chromatogram）。遺憾的是，在隨後的二十年內這一新的分析技術都沒有得到科學界的注意和重視。

直到1931年，庫恩（Kohn）報道了他們關於胡蘿蔔素的分離方法時，色譜法才引起了科學界的廣泛注意。

1941年，馬丁（Matin）和辛格（Synge）用一根裝滿硅膠微粒的色譜柱，成功地完成了乙酰化氨基酸混合物的分離，建立了液液分配色譜方法，他們也因此獲得了1952年諾貝爾化學獎。1944年，康斯坦因（Consden）和馬丁（Matin）建立了紙色譜法。1949年，馬丁建立了色譜保留值與熱力學常數之間的基本關係式，奠定了物化色譜的基礎。1952年，馬丁和辛格創立了氣液色譜法，成功地分離了脂肪酸和脂肪胺系列，並對此法的理論與實驗做了精闢的論述，建立了塔板理論。1956年，斯達（Stall）建立了薄層色譜法。同年，范·底姆特（Van Deemter）提出了色譜理論方程；後來吉丁斯（Giddings）對此方程作了進一步改進，並提出了摺合參數的概念。這一系列色譜技術和理論的發展都為HPLC 的問世打下了紮實的基礎。

1960年代早期，由於氣相色譜對高沸點有機物分析的局限性，為了分離蛋白質、核酸等不易氣化的大分子物質，分析化學家們把目光轉向了液相色譜。液相色譜也的確從蛋白質中分離出了純的化合物，但使用液相色譜又出現了一個新的問題：分離時間相當長。當時所使用的色譜柱效率非常低，具有代表性的柱子是一米來長或更長，為了獲得必要的分辨率，有時還得使用多根柱，液體流動的產生靠重力，其流動速度是每小時幾毫升或更少，無計算機自動操作儀器和進行數據收集。當時的生物學工作者往往要經過好幾年的努力才能從一個組織中把蛋白質完全分離出來。

在儀器發展方面，HPLC 的第一個雛形是由斯坦因（Stein）和莫爾（Moore）於1958年發展起來的氨基酸分析儀（AAA），這種儀器能夠進行自動分離和蛋白質水解產物的分析。在六十年代早期的相關進展是莫爾（Moore）發展起來的凝膠滲透色譜（GPC）。不久以後，沃特世（Waters）有限公司製造了商業GPC儀，這種儀器經過微小的改進之後可用於HPLC分離。

1968～1971年間，第一台普遍適用的HPLC商用系統被推出。這種新的色譜儀是由科克蘭（Kirkland）、哈伯、荷瓦斯（Horvath）、莆黑斯（Preiss）和里普斯克（Lipsky）等人研製發明的。從此，開啟了高效液相色譜的時代，也成之為現代液相色譜。

Richard Henry (circa 1969) at DuPont Instrument Products Division in front of a Medel 820 HPLC system

高效液相色譜使用粒徑更細的固定相填充色譜柱，提高色譜柱的塔板數，以高壓驅動流動相，使得經典液相色譜需要數日乃至數月完成的分離工作得以在幾個小時甚至幾十分鐘內完成。

Development of HPLC particles instrument pressure requirements increase dramatically as particle size decrease.

「液相色譜儀」的結構及原理

液相色譜儀的結構

高效液相色譜儀主要由儲液器、高壓泵、進樣器、色譜柱、檢測器、記錄儀六部分組成。

1、儲液器

儲液器是用於存放溶劑的裝置。貯液器中的溶劑必須很純，貯液器材料要耐腐蝕，對溶劑呈惰性，一般情況下通常採用1升~2升的大容量玻璃瓶，也可採用不鏽鋼製成的容器，貯液器應配有溶劑過濾器，以防止流動相中的顆粒進入泵內，溶劑過濾器一般用耐腐蝕的鎳合金製成，孔隙大小一般為2μm。

2、高壓泵

高壓泵應耐壓、耐腐蝕、密封性好。其主要用於輸送流動相，其壓力一般為幾兆帕至數十兆帕，這時液體的黏度比氣體大 100 倍。同時由於固定相的顆粒極細，柱內壓降大，為保證一定的流速，必須藉助高壓迫使流動相通過柱子。高壓泵應無脈動或脈動極小，以保證輸出的流動相具有恆定的流速，同時採用脈動阻尼裝置可將產生的脈動除去，使流動相的流量變動範圍不宜超過 2%~3%。高壓泵主要分為恆壓泵、恆流泵和螺旋傳動注射泵三類。

（1）恆壓泵

恆壓泵輸出的壓力恆定，當具有一定壓力的氣體作用在一個大面積活塞上,大面積活塞再驅動一個小面積活塞，小面積活塞承受的壓力是大面積活塞的幾十倍，從而得到壓力恆定的流出液。

（2）恆流泵

恆流泵的主要功能是輸出的流量恆定，如往複柱塞泵、螺旋傳動注射泵等。往複柱塞泵與恆壓泵不同，通常採用電驅動活塞，當活塞迅速向上動時，由於減壓使入口止逆閥開啟，出口止逆閥關閉，貯液器中的流動相被吸入柱內，形成一個循環，然後再開始下一個循環。使用這種泵時一定要連接脈動阻尼器，將產生的脈動除去，若採用雙活塞泵，使雙活塞在相移180°下工作，可使脈動互相抵消，減小噪聲。往複柱塞泵的流量與外界阻力無關，恆流泵具有體積小的特點，非常適合於梯度洗脫。

（3）螺旋傳動注射泵

螺旋傳動注射泵是用電力以很慢的恆定速率驅動活塞，使流動相連續輸出，當活塞到達末端時，輸出中止，然後由另一個吸入衝程使溶劑重新充滿再開始第二次輸出，輸出時間的長短決定於泵腔體積及輸出流量。

3、進樣器

液相色譜儀進樣器普遍使用高壓進樣閥，用微量注射器將樣品注入樣品環管，使用的樣品環管分別有不同的尺寸，可根據分析要求選用。當進樣閥手柄放在吸液位置時，流動相直接通過孔的通路流向色譜柱，樣品通過注射器從另外的位置進入樣品環管，如果有過量的樣品則會從出口孔排出，然後將手柄轉到進樣位置，此時流動相便將樣品帶進色譜柱。

4、色譜柱

色譜柱是整個色譜系統的心臟，它的質量優劣直接影響到分離的效果。一般情況下色譜柱通常採用不鏽鋼管製成，並且柱內壁必須光潔平滑，否則內壁的縱向溝痕和表面多孔性也會引起譜帶的展寬。柱接頭的體積應儘可能小，柱長一般為10cm~25cm，內徑4mm ~5mm。若使用直徑為5μm~10μm固定相顆粒，理論塔板可達到 5×104/m。尺寸排阻色譜柱的內徑通常大於5mm，製備色譜柱則會更大；為了減少溶劑用量，可採用微徑柱，內徑為1mm，長度為30mm~75mm，若採用3μm顆粒，理論塔板數高達1×105/m。

為了保護分析柱不被污染，有時需在分析柱前加一短柱，約數厘米長，此柱稱為保護柱。為了防止保護柱過分增加柱阻力，在保護柱中使用的顆粒大小約為10μm~30μm。

5、檢測器

液相色譜儀常用的檢測器有紫外吸收檢測器、光電二極管陣列檢測器、示差折光檢測器、熒光檢測器、蒸發光散射檢測器等。

液相色譜儀的工作原理

儲液器中的流動相通過高壓泵注入系統，試樣溶液經進樣器進入流動相，被流動相載入色譜柱內，試樣溶液中的各組分在兩相中具有不同的分配係數，因此，當兩相相對運動，經過反覆多次的吸附-解吸分配過程，各組分在移動速度上產生較大的差別，被分離成單個組分依次從柱內流出，通過檢測器時，樣品濃度被轉換成電信號傳送到記錄儀，數據以圖譜形式打印出來。

高效液相色譜基本構造圖（圖源網絡）

「液相色譜儀」的分類

液相色譜根據分離機理的不同可分為：液-固吸附色譜、液-液分配色譜、離子交換色譜、離子對色譜法、分子排阻色譜(或凝膠滲透色譜)等。

1、液-固吸附色譜

流動相為液體，固定相為固體吸附劑，是通過組分在兩相間的多次吸附與解吸平衡實現分離的。適合分離的物質為中等相對分子質量的油溶性試樣，凡是能夠用薄層色譜分離的物質均可用此法分離。

2、液-液分配色譜

流動相和固定相都是液體的色譜法即為液液分配色譜。該方法是利用樣品組分在兩種不相溶的液相間的分配來進行分離。一種液相為流動相，另一種是塗於載體上的固定相。可以分離各種無機、有機化合物

流動相極性小於固定相極性的液-液色譜法稱為正相分配色譜法。

流動相極性大於固定相極性的液-液色譜法稱為反相分配色譜法。

3、離子交換色譜

以離子交換樹脂或化學鍵合離子交換劑為固定相，利用被分離組分離子交換能力的差別或選擇性係數的差別而實現分離。

按照可交換離子所帶電荷符號的不同又可分為陽離子交換色譜法和陰離子交換色譜法。

離子交換色譜主要是用來分離離子或可離解的化合物。它不僅廣泛地應用於無機離子的分離，而且廣泛地應用於有機和生物物質，如氨基酸、核酸、蛋白質等的分離，在生物化學領域得到了廣泛的應用。

4、離子對色譜法

將一種或多種與目標化合物離子電荷相反的離子（稱為離子對）加入到流動相或者固定相中，使其與目標化合物離子結合形成離子對化合物，從而影響目標化合物的保留行為。離子對色譜和反相色譜有很多共同的地方。使用的固定相和流動相大致相似，不同的是，在離子對色譜的流動相中加入了離子對試劑。

離子對試劑通常分為以下兩類：

用於酸性化合物：三乙胺，四丁基氫氧化銨，四丁基溴化銨，十二烷基三甲基氯化銨等。

用於鹼性物質：三氟乙酸，戊烷磺酸鈉，己烷磺酸鈉，庚烷磺酸鈉，辛烷磺酸鈉，十二烷基磺酸鈉，十二烷基硫酸鈉等。

具體離子對試劑的選擇沒有什麼特殊的要求，根據目標化合物的酸鹼性進行選擇就好。如果目標化合物是弱酸性或弱鹼性的，離子對試劑對應選擇強鹼性或強酸性為最佳。

離子對色譜法特別適合一些生化試樣如核酸、核苷、生物鹼以及藥物等分離。

5、分子排阻色譜法

分子排阻色譜法又稱空間排阻色譜法（SEC）、凝膠色譜法，是利用多孔凝膠固定相的獨特性產生的一種，主要根據凝膠孔隙的孔徑大小與高分子樣品分子的線團尺寸間的相對關係而對溶質進行分離分析的方法。

適用於對未知樣品的探索分離，它能很快提供樣品按分子大小組成的全面情況，並迅速判斷樣品是簡單的還是複雜的混合合物，並提供樣品中各組分的近似分子量。這種分離方法不宜用於分子大小組成相似或分子大小僅差10%的組分分析，如同分異構體的分離不宜用分子排阻色譜法。

常用的幾種「液相色譜檢測器」

液相色譜檢測器常用的一般以下幾種：

1、紫外可見檢測器

紫外可見光檢測器是應用最廣泛的檢測器，遵循的原理是郎伯比爾定律。

紫外可見檢測器靈敏度高，線性範圍寬，對流速和溫度變化不敏感，可用於梯度洗脫分離。該檢測器要求被檢測樣品組分有紫外-可見光吸收，而使用的流動相無吸收，或在被測組分吸收波長處無吸收。一般選擇在待分析物最大吸收波長處進行檢測，以獲得最高靈敏度和抗干擾能力。在沒有最大吸收時，可採用末端吸收。檢測波長的選擇除取決於待測物質的成分和分子結構外，還必須考慮流動相組成、共存組分干擾等因素。特別是各種溶劑都有一定的透過波長下限值，超過這個波長，溶劑的吸收會變得很強，以至於不能很好地測出待測物質的吸收強度。

2、光電二極管陣列檢測器（Photodiode Array Detector）

簡稱PDA，又稱為二極管陣列檢測器（DAD）。這種檢測器以光電二極管陣列作為檢測元件，可進行多通道並行檢測，在一次色譜測量中，可同時獲得時間、波長、吸光度三者的關係，通過計算機處理，在熒光屏上顯示出三維圖譜，也可作出任意波長的吸光度-時間曲線和任意時間的吸光度-波長曲線。

3、示差折光檢測器

示差折光檢測器是一種通用型檢測器。基於連續測定色譜柱流出物光折射率的變化而用於測定溶質濃度，溶液的光折射率是溶劑流動相和溶質各自的折射率乘以其物質的量濃度之和，溶有樣品的流動相和流動相本身之間光折射率之差即表示樣品在流動相中濃度。

原則上，凡是與流動相光折射率有差別的樣品都可用它來測定，其檢測限可達(10^-6～10^-7)g/ml。應注意的是，選擇溶劑時必須考慮溶劑的光折射率。但這種檢測器靈敏度低，對溫度、流動相組成等的變化敏感，而且與梯度洗脫不相容，很大程度地限制了它的應用範圍。在藥物分析中，這種檢測器多用於多糖類、萜類化合物等分子量和含量的測定。

4、熒光檢測器（Fluorescence Detector）

熒光檢測器是基於化合物的光致發光現象，熒光檢測器流通池為直角形的試樣池，用石英材料製成。這一檢測器特別適用於痕量組分和能顯示熒光的物質檢測。這種檢測器具有極高的靈敏度和良好的選擇性。一般來說，它比紫外吸收檢測器的靈敏度要高10-1000倍，可達μg/L級，而且需要的試樣很少，因此在藥物和生化分析中有着廣泛的應用。

5、蒸發光散射檢測器（ELSD）

蒸發光散射檢測器是一種新型的通用型質量檢測器，不同於紫外和熒光檢測器，ELSD的響應不依賴於樣品的光學特性，任何揮發性低於流動相的樣品均能被檢測，不受其官能團的影響。ELSD檢測過程主要分為三個步驟：首先是霧化過程，用惰性氣體或凈化空氣將色譜柱流出物霧化；第二步是蒸發過程，流動相在加熱管（漂移管）中蒸發；第三步是檢測，測定留下來的樣品顆粒的光散射。

「高效液相色譜儀「的應用

1、在生命科學領域的應用

氨基酸、多肽、蛋白質、核鹼、核苷、核苷酸、核酸（RNA、DNA）等重要的生命物質，可以採用液相色譜儀純化、分析測定。

2、藥物分析

合成藥物的純化及質量控制，中草藥有效成分的分離製備及純度測定，以及臨床醫學的葯代動力學研究中的分離分析都採用液相色譜法。據報道，除聚合物外，約80%的藥物都能用液相色譜儀進行分離和純化。特別是手性藥物的分離分析，液相色譜儀已經是一種重要的分析方法。

3、食品分析

主要可分為：食品成分，特別是營養物質，如糖、有機酸、維生素、蛋白質、氨基酸、脂肪等分析；食品添加劑，如防腐劑、抗氧化劑、合成色素、甜味劑和保鮮化學物質的分析；食品中有機污染物，如農獸葯殘留和真菌黴素等的分析。

4、環境監測

高效液相色譜儀已在環境監測中得到廣泛應用，特別適用於分子量大、揮發性低、熱穩定性差的有機污染物的分離和分析。如多環芳烴、酚類、多環聯苯、鄰苯二甲酸酯類、聯苯胺類、陰離子表面活性劑、農業生產體系農藥、除草劑等。

5、精細化工

對於一些具有較高分子量和較高沸點的有機化合物，如高碳數脂肪族或芳香族的醇、醛和酮、醚、酸、酯等化工原料，以及各種表面活性劑、藥物、農藥、染料等化工產品，均可液相色譜儀分析。

「液相色譜儀」常見故障及解決

高效液相作為一種高精密儀器，如果在使用過程中不按照正確操作的話，就容易導致一些問題。其中比較常見的就是柱壓問題、漂移問題、峰型異常問題。

1、柱壓問題

柱壓問題是使用高效液相色譜儀過程中需要密切注意的地方，柱壓的穩定與色譜圖峰形的好壞、柱效、分離效果及保留時間等密切相關。所謂柱壓穩定並不是指壓力值穩定於一個恆定值而是指壓力波動範圍在50 PSI（3.3 Bar）之間（在使用梯度洗脫時，柱壓平穩緩慢的變化是允許的）。壓力過高、過低都屬於柱壓問題。

（1）壓力過高

這是高效液相色譜儀在使用中最常見的問題，指的是壓力突然升高，一般都是由於流路中有堵塞的原因。此時，我們應該分段進行檢查。

a. 首先斷開真空泵的入口處，此時PEEK管里充滿液體，使PEEK管低於溶劑瓶，看液體是否自由滴下，如果液體不滴或緩慢滴下，則是溶劑過濾頭堵塞。

處理方法：用30%的硝酸浸泡半個小時，在用超純水沖洗乾淨。如果液體自由滴下，溶劑過濾頭正常，再檢查；

b. 打開Purge閥，使流動相不經過柱子，如果壓力沒有明顯下降，則是過濾白頭堵塞。

處理方法：將過濾白頭取出，用10%的異丙醇超聲半個小時。如果壓力降至100 PSI（6.7 Bar）以下，過濾白頭正常，再檢查；

c. 把色譜柱出口端取下，如果壓力不下降，則是柱子堵塞。

處理方法：如果是緩衝鹽堵塞，則用95%的水沖至壓力正常。如果是一些強保留的物質導致堵塞，則要用比現在流動相更強的流動相衝至壓力正常。假如按上面的方法長時間沖洗壓力都不下降，則可考慮將柱子的進出口反過來接在儀器上，用流動相衝洗柱子。這時，如果柱壓仍不下降，只有換柱子入口篩板，但一旦操作不甚，很容易造成柱效下降，所以盡量少用。

（2）壓力過低

a. 壓力過低的現象一般是由於系統泄漏，處理方法：尋找各個接口處，特別是色譜柱兩端的接口，把泄漏的地方旋緊即可；

b. 當然還有一個原因就是泵里進了空氣，但此時表現的往往是壓力不穩，忽高忽低，更嚴重一點會導致泵無法吸上液體。處理方法：打開Purge閥，用3~5 ml/min的流速沖洗，如果不行，則要用專用針筒在排空閥處借住外力將氣泡吸出。

2、漂移問題

主要包括基線漂移和保留時間漂移。

（1）基線漂移

一般說來，儀器剛起動時，基線容易漂移，大概要半個小時的平衡時間。此外，在低波長下（220 nm）平衡時間相對會比較長。如果在實驗過程中發現基線漂移，需要考慮以下原因：

a. 柱溫波動。

解決方法：控制好柱子和流動相的溫度，檢查是否有打開的窗戶或空調對着柱溫箱；

b. 流通池被污染或有氣體。

解決方法：用甲醇或其他強極性溶劑沖洗流通池（最好斷開柱子）。如有需要，可以用1N的硝酸（不要用鹽酸）；

c. 紫外燈能量不足。

解決方法：更換新的紫外燈；

d. 流動相污染、變質或由低品質溶劑配成。

解決方法：檢查流動相的組成，使用高品質的化學試劑及HPLC級的溶劑；

e. 樣品中有強保留的物質以饅頭峰樣被洗脫出，從而表現出一個逐步升高的基線。

解決方法：使用保護柱，同時，在分析過程中，定期用強溶劑沖洗柱子；

f. 檢測器沒有設定在最大吸收波長處。

解決方法：將波長調整至最大吸收波長處；

g. 流動相的PH值沒有調節好。

解決方法：加適量的酸或鹼調至最佳PH值。

（2）保留時間漂移

保留時間重現是液相性能好壞的一個重要標誌。同一種物質，兩次保留時間相差不要超過半分鐘，超過了可看做保留時間漂移，則無法準確定性，此時需考慮以下原因：

a. 溫控不當。解決方法：調好柱溫，檢查是否有打開的窗戶或空調對着柱溫箱；

b. 流動相比例變化。解決方法：檢查四元泵的比例閥是否有故障；

c. 色譜柱沒有平衡。解決方法：在每一次運行之前給予足夠的時間平衡色譜柱；

d. 流速變化。解決方法：重新設定流速；

e. 泵中有氣泡。解決方法：從泵中除去氣泡。

3、峰形異常問題

峰型問題是色譜分析的主要問題，在做液相過程中，一般是要變換不同的條件來改善不好的峰型。對於各種各樣的異常峰，要區別對待，以下列出了幾種常見峰形異常問題及解決方法。

a. 色譜圖中未出峰。

解決方法：系統未進樣或樣品分解；泵未輸液或流動相使用不正確；檢測器設置不正確；針對以上情況成因作相應調整即可。

b. 一個峰或幾個峰是負峰。

解決方法：流動相吸收本底高；進樣過程中進入空氣；樣品組分的吸收低於流動相。

c. 所有峰均為負峰。

解決方法：信號電纜接反或檢測器輸出極性設置顛倒；光學裝置尚未達到平衡。

d. 所有峰均為寬峰。

解決方法：系統未達到平衡；溶解樣品的溶劑極性比流動相差很多；色譜柱尺寸及類型選擇不正確；色譜柱或保護柱被污染或柱效降低；溫度變化造成的影響。

e. 所出峰比預想的小。

解決方法：樣品黏度過大；進樣品故障或進樣體積誤差；檢測器設置不正確；定量環體積不正確；檢測池污染；檢測器燈出現問題。

f. 出現雙峰或肩峰。

解決方法：進樣量過大；樣品濃度過高；保護柱或色譜柱柱頭堵塞；保護拄或色譜柱污染或失效；柱塌陷或形成短通道。

g. 前伸峰。

解決方法：進樣量或樣品濃度高；溶解樣品的溶劑較流動相極性強；保護柱或色譜柱污染或失效。

h. 拖尾峰。

解決方法：柱超載，降低樣品量；增加柱直徑採用較高容量的固定相；峰干擾，對樣品進行清潔過濾；調整流動相；硅羥基作用，加入三乙胺，用鹼致鈍化柱增加緩衝液或鹽的濃度降低流動相pH值；柱內燒結不鏽鋼失效，更換燒結不鏽鋼；加在線過濾器，對樣品進行過濾；死體積或柱外體積過大，將連接點降至最低；儘可能使用內徑較細的連接管；柱效下降，更換柱子；採用保護柱，對柱子進行再生。

i. 出現平頭峰。

解決方法：檢測器設置不正確；進樣體積太大或樣品濃度太高。

j. 出現鬼峰。

解決方法：進樣閥殘餘峰，在每次進完樣後用充足的時間來平衡和清洗系統；樣品中存在未知物，改進樣品的預處理；流動相污染，更換新流動相，儘可能現配現用，隔夜的流動相再次使用時要過濾；儘可能使用HPLC級試劑；流路中有小的氣泡，打開Purge閥，加大流速排除。

在排除故障時要遵循以下原則：（1）一次只改變一個因素，確定假定因素與問題之間的聯繫；（2）如果通過更換組件來排查故障時要注意將拆下的完好組件裝回原位，避免浪費；（3）養成良好的記錄習慣，這是成功進行故障排除的關鍵。

「液相色譜儀」的維護小技巧

1、流動相溶劑瓶的保養

溶劑瓶是流動相的起點，通常是盛放水相溶液或是有機相溶液。

（1）對於水相溶液來說，首要的問題是防止污染。對於溶劑瓶，我們要做的非常重要的工作就是勤換流動相，常換常新。

（2）對於有機相溶液，可以不用擔心細菌繁殖的問題。但是有機相容易發生聚合，特別是乙腈在適宜的光照條件下極易發生聚合，瓶子里就會出現一些絮狀的聚合沉澱物。為了防止聚合過程的發生，裝乙腈時要用棕色的溶劑瓶，避免陽光直射，更換乙腈時應當棄去瓶底剩餘的溶液。

（3）清洗溶劑瓶里的過濾頭，其作用是為了防止溶液瓶中的顆粒雜質進入到儀器的流路系統中，它的材質通常分為玻璃燒結石英和不鏽鋼，如果不慎堵塞會造成流動相吸液不暢，因此必須進行清洗，玻璃材質的通常是用稀硝酸泡，而不鏽鋼材質的可以直接進行超聲清洗。

2、高壓泵的保養

泵是液相色譜的重要組成部分，泵將流動相從溶劑瓶輸送到液相流路系統中，並要在高壓下保持流量和壓力的穩定。

（1）泵壓力波動，很多情況下，泵的問題反映在壓力上，壓力波動又是常見的一類問題。通常我們可以通過重新清洗流路和再次脫氣流動相加以解決。

（2）過濾白頭保養，在泵的維護里還有一項常做的工作就是更換清洗閥上的過濾白頭，通常判斷的標準是純水以5mL/min流速清洗的時候，如果壓力超過1MPa則考慮更換。

3、進樣器的保養

進樣器分手動和自動兩大類，雖然兩者工作模式不同，但使用的要點是基本一致的。

（1）防止交叉污染，自動進樣器常見的問題是交叉污染，交叉污染產生的原因很直接，樣品殘留在進樣針內外表面，並隨下一次進樣進入色譜系統。要解決交叉污染，主要靠清洗。自動進樣器都會有洗針的功能，如果樣品濃度較高或者是吸附性比較強，一定要打開此功能；如果未打開洗針功能，污染可能已經殘留在了針座或流通閥上，那麼這兩個部件需及時超聲清洗。

出現在自動進樣器上的另外一個問題是峰面積重現性差，考慮可能與自動進樣器吸取樣品有關。首先觀察樣品的液面是不是足夠高，以保證進樣器可以吸到樣品。排除這個問題後，再察看自動進樣器的設置，對於一些粘度大的樣品，要降低自動進樣器的吸取速度。

（2）精細操作，手動進樣器應使用液相色譜儀專用平頭進樣針，進樣時插針應插到底，不使用時將針頭留在進樣器內，使用前後都要及時清洗。

4、色譜柱的保養

色譜柱是化合物分離的關鍵。保養良好的色譜柱具有很高的塔板數，且儀器基線平穩。

（1）色譜柱不能夠碰撞、彎曲或強烈振蕩。安裝時要保證閥件或管路的清潔。

（2）應逐漸改變溶劑的組成，特別是反相色譜中，不應直接從有機溶劑改變為全部是水，反之亦然。

（3）分析結束後，要清洗進樣閥中殘留的樣品，並用流動相或適當的溶劑清洗色譜柱。

（4）避免將基質複雜的樣品尤其是生物樣品直接注入柱內，需要對樣品進行預處理或者在進樣器和色譜柱之間連接一保護柱。保護柱一般是填有相似固定相的短柱。保護柱可以而且應該經常更換。

（5）經常用強溶劑沖洗色譜柱，清除保留在柱內的雜質。在進行清洗時，對流路系統中流動相的置換應以相混溶的溶劑逐漸過渡，每種流動相的體積應是柱體積的20倍左右，即常規分析需要50~75ml。

下面列舉一些色譜柱的清洗溶劑及順序，作為參考：

硅膠柱以正已烷（或庚烷）、二氯甲烷和甲醇依次沖洗，然後再以相反順序依次沖洗，所有溶劑都必須嚴格脫水。甲醇能洗去殘留的強極性雜質，已烷使硅膠表面重新活化。

反相柱以水、甲醇、乙腈、一氯甲烷（或氯仿）依次沖洗，再以相反順序依次沖洗。

如果下一步分析用的流動相不含緩衝液，那麼可以省略最後用水沖洗這一步。一氯甲烷能洗去殘留的非極性雜質，在甲醇（乙腈）沖洗時重複注射100~200µl四氫呋喃數次有助於除去強疏水性雜質。四氫呋喃與乙腈或甲醇的混合溶液能除去類脂。有時也注射二甲亞碸數次。此外，用乙腈、丙酮和三氟醋酸（0.1%）梯度洗脫能除去蛋白質污染。

陽離子交換柱可用稀酸緩衝液沖洗，陰離子交換柱可用稀鹼緩衝液沖洗，除去交換性能強的鹽，然後用水、甲醇、二氯甲烷（除去吸附在固定相表面的有機物）、甲醇、水依次沖洗。

（6）保存色譜柱時應將柱內充滿乙腈或甲醇，柱接頭要擰緊，防止溶劑揮發乾燥。禁止將緩衝溶液留在柱內靜置過晚上或更長時間。

（7）色譜柱使用過程中，如果壓力升高，一種可能是燒結濾片被堵塞，這時應更換濾片或將其取出進行清洗；另一種可能是大分子進入柱內，使柱頭被污染；如果柱效降低或色譜峰變形，則可能柱頭出現塌陷，死體積增大。

在後兩種情況發生時，小心擰開柱接頭，用潔凈小鋼將柱頭填料取出1~2mm高度（注意把被污染填料取凈）再把柱內填料整平。然後用適當溶劑濕潤的固定相（與柱內相同）填滿色譜柱，壓平，再擰緊柱接頭。這樣處理後柱效能得到改善，但是很難恢復到新柱的水平。

柱子失效通常是柱端部分，在分析柱前裝一根與分析柱相同固定相的短柱（5~30mm），可以起到保護、延長柱壽命的作用。

通常以硅膠為基質的色譜柱，只能在pH2~9範圍內使用。柱子使用一段時間後，可能有一些吸附作用強的物質保留於柱頂，特別是一些有色物質更易看清被吸着在柱頂的填料上。新的色譜柱在使用一段時間後柱頂填料可能塌陷，使柱效下降，這時也可補加填料使柱效恢復。

5、檢測器的保養

（1）光源部分

檢測器中非常重要的部件是光源，光源對發射能量有要求，一旦能量衰減到一定程度，就會出現基線噪聲變大，靈敏度降低等一系列影響使用的問題，因此光源是一個消耗品。通常紫外燈的壽命是2000h，當到達這個時限的時候，我們就要特別關注燈的能量狀況，可以通過儀器維護軟件中自帶的「燈能量測試」功能來判斷，測試的結果會分別評估低、中、高三個波長段的能量，一旦某個波長段的測試結果顯示失敗，就表示需要更換燈。

（2）檢測池

檢測器中另一個重要部件是檢測池，也叫流通池。通常大家關心的一個問題是檢測池被堵掉，因為檢測池通常不是很耐壓，所以一旦被堵就很可能造成損壞。事實上檢測池通常不太容易被堵，原因是幾乎所有的顆粒雜質都會被色譜柱攔下了，所以堵塞檢測器的東西基本都不是來自樣品的，很可能是後來「產生」的，比如含鹽流動相殘留在檢測池中導致鹽析出。

「液相色譜儀」的操作流程及注意事項

使用前期準備工作：

1. 始終保持高效液相色譜儀器包括內在系統的清潔。

2. 室內溫度始終保持恆定，因為室溫的變化對高效液相色譜檢測器有影響。

3. 所有溶液、試劑、樣品、標準溶液、注射劑等都應事先準備好。

4. 最好提前準備好備用電源防止停電。

HPLC操作流程：

1．將已經過濾並脫氣的流動相注入儲液罐；

2. 用流動相衝洗金屬過濾器，然後將過濾器浸入儲液罐的流動相中；

3. 將儲液罐放置在一定的高度，以避免由於搬運和其他操作人員的移動而造成不必要的跌落。

4. 然後按以下順序依次啟動高效液相色譜儀：泵→檢測器→高效液相色譜軟件→按預先計劃的方法設置軟件參數，如分析時間、檢測波長、流速等。

5. 啟動泵，運行5分鐘，主要是為了排除系統中的氣泡，結束後關閉所有排氣閥；