「醫療器械藍皮書」宏基因組測序技術在病原微生物檢測中的應用

【編者按】本文摘選自《中國醫療器械行業發展報告（2021）》B29，作者王佳偉，首都醫科大學附屬北京同仁醫院神經內科主任兼醫院中心實驗室主任,美國約翰霍普金斯大學博士後, 醫學博士,教授, 主任醫師, 博士生導師,美國神經科學學會會員；夏涵，予果生物技術（北京）有限公司，法定代表人總經理；馬自立，予果生物技術（北京）有限公司，副總經理。

【摘 要】病原微生物檢測能夠對感染性疾病的病原體或者代謝物進行檢測分析，是體外診斷試劑（In Vitro Diagnosis，IVD）的細分領域之一。目前病原微生物診斷技術不斷發展，傳統病原微生物培養技術主要有分離培養、塗片鏡檢、生化鑒定、抗原抗體免疫等，面臨著陽性率低、診斷周期長，無法達到檢測病原體的要求。分子生物學檢測方法快速發展，有諸多方法可將少量的核酸分子擴增到易於檢測的水平。這些檢測方法包括恆溫擴增技術(LAMP)、實時熒光定量PCR等。伴隨着二代測序等新技術的出現，給臨床病原微生物的診斷提供了新的解決方案，特別是普通實驗室難以培養、生長緩慢、未知病原體、罕見病原體等具有明顯優勢。但二代測序方法目前仍然面臨若干挑戰，如檢測成本偏高、對實驗環境要求嚴苛、部分檢測結果需人工解讀等。分子診斷的新方法和新技術正在改變我們實踐臨床微生物學的方式，這影響了病原微生物相關檢測行業。

【關鍵詞】病原體 核酸 二代測序

【好消息】：《醫療器械藍皮書》第五部 《中國醫療器械行業發展報告（2021）》出版上市

（以下為正文）

病原微生物檢測能夠對感染性疾病的病原體或者代謝物進行檢測分析，是體外診斷試劑（In Vitro Diagnosis，IVD）的細分領域之一。微生物檢測主要是對人類感染性疾病的病原體或病原體的代謝物檢測和分析，包括細菌培養、鑒定和葯敏結果分析等，目的是為臨床治療提供診療依據，從而為患者選擇最適合藥物及治療方法。基於核酸擴增的技術可提供靈敏而特異的結果，並具有比以往更短的檢測時間。

2019年12月，新冠疫情在武漢爆發，隨着新冠疫情的發展和蔓延，2020年新型冠狀病毒成為大眾耳熟能詳的詞語。在2020年中，國家食品藥品監督管理總局總共審批通過1026個三類註冊證，關於病原微生物檢測的產品多達111個，其中新型冠狀病毒（2019-nCoV）相關產品達到54個。

國家衛健委發佈至2021年2月1日每天單管核酸檢測能力已經提高到每天1600萬份，已經比2020年3月份的126萬份/天提高了11倍多。足以說明分子診斷領域正處于飛速發展的黃金期。

一 核酸檢測方法在病原微生物領域應用

臨床微生物學實驗室的基本目標是在臨床樣本中確定並識別病毒、細菌、真菌或寄生蟲這些病原體，並在可能的情況下提供有助於指導臨床管理甚至預後的其他信息，例如抗生素敏感性或有無毒力因子。

到目前為止，臨床微生物學實驗室主要通過基於生長的檢測和生化測試來達到這些目標。例如，細菌根據其特有的微觀形態、生長所需的營養和催化某些反應的能力，病毒在組織培養中的細胞病變效應以及真菌和寄生蟲的顯微形態；通過評估抗生素存在情況下微生物的生長情況來確定抗生素敏感性。這些技術可靠但耗時。核酸檢測的使用越來越成為臨床微生物實驗室用於檢測、定量和/或鑒定的標準方法，逐漸取代了表型特徵鑒別和顯微鏡鏡觀察的方法。

臨床樣本特異性DNA和RNA鹼基序列的檢測與定量技術已成為臨床診斷細菌、病毒、寄生蟲和真菌感染的強大工具。核酸檢測主要有4個用途。第一，用於定性/定量檢測臨床樣本中的病原體。第二，用於鑒定傳統方法難以鑒定的病原體。第三，用於確定同一病原體的兩個或更多分離株是否有親緣性(即是否屬於同一「克隆」或「菌株」)。第四，用於預測病原體對藥物的敏感性。其中一些已經國家藥品監督管理局(NMPA)批准用於臨床診斷[[2]]。

有諸多方法可將少量的核酸分子擴增到易於檢測的水平。這些檢測方法包括恆溫擴增技術(LAMP)、實時熒光定量PCR(qPCR)和測序方法。在任何情況下，病原體特異性DNA或RNA序列的指數式擴增都依賴於退火到目標序列的引物。擴增後的核酸可以在反應完成後檢測，也可以在擴增過程中(實時檢測)檢測。核酸擴增檢測的靈敏度遠遠高於培養法、免疫學檢測抗體等傳統檢測方法，且免疫學檢測抗體主要用於回顧性診斷。與其他方法相比，病毒培養是一種更耗時的方法。

隨着艾滋病相關疾病、巨細胞病毒感染以及乙型和丙型肝炎病毒感染的新治療方案的出現，在治療開始後的不同時間需通過確定基因型和病毒載量來監測對治療的反應。定量核酸擴增方法可用於檢測HIV(PCR)、巨細胞病毒(PCR)、乙型肝炎病毒(PCR)和丙型肝炎病毒(PCR和TMA)。許多實驗室已經通過核酸擴增方法的分析物專用試劑對這些病原體和其他病原體(如EB病毒)進行了驗證和定量分析[[3]]。

目前，國家藥品監督管理局批准多種病原體核酸檢測試劑盒，包括結核分枝桿菌、淋病奈瑟菌、沙眼衣原體、B群鏈球菌和耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的檢測。同時，國家藥品監督管理局批准的多重核酸檢測方法也可用於同時檢測一些呼吸道或生殖道病原體（見表1）。同樣，許多實驗室已經將市售試劑和分析物特定試劑用於診斷性試驗。

表1 國家藥品監督管理局批准多重呼吸道核酸檢測方法匯總

產品名稱	方法學	生產企業	樣本類型	預期用途
六項呼吸道病毒核酸檢測試劑盒（恆溫擴增芯片法）	恆溫擴增芯片法	成都博奧晶芯生物科技有限公司	咽拭子	新型冠狀病毒（2019-nCoV）S和N靶基因以及甲型流感病毒、新型甲型H1N1流感病毒（2009）、甲型H3N2流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒核酸。
甲型/乙型流感及呼吸道合胞病毒核酸聯合檢測試劑盒（實時熒光PCR法）Xpert Xpress Flu/RSV Assay	實時熒光PCR法	美國賽沛公司Cepheid	鼻咽拭子	甲型流感病毒、乙型流感病毒和呼吸道合胞病毒（RSV）RNA。
13種呼吸道病原體多重檢測試劑盒（PCR毛細電泳片段分析法）	PCR毛細電泳片段分析法	寧波海爾施基因科技有限公司	痰液或咽拭子	甲型流感病毒（H7N9、H1N1、H3N2、H5N2）、甲型流感病毒H1N1(2009)、季節性H3N2病毒、乙型流感病毒（Victoria株和Yamagata株）、腺病毒（B組、C組和E組）、博卡病毒、鼻病毒、副流感病毒（1型、2型、3型和4型）、冠狀病毒（229E、OC43、NL63和HKU1）、呼吸道合胞病毒（A組和B組）、偏肺病毒、肺炎支原體和衣原體（沙眼衣原體和肺炎衣原體）。其中腺病毒、副流感病毒、冠狀病毒、呼吸道合胞病毒和衣原體檢測結果不分型。
七項呼吸道病原體核酸檢測試劑盒(雙擴增法)	雙擴增法	武漢中幟生物科技股份有限公司	咽拭子	甲型流感病毒的H1N1/H3N2型、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、人副流感病毒的1/2/3型、腺病毒的B/E屬、肺炎支原體、肺炎衣原體的核酸。本產品可區分樣本中不同病原體，但無法區分同一病原體的不同型別。
三項呼吸道病毒核酸檢測試劑盒（雙擴增法）	雙擴增法	武漢中幟生物科技股份有限公司	咽拭子	呼吸道合胞病毒、人副流感病毒的1/2/3型、腺病毒的B/E屬的核酸。
呼吸道病毒核酸六重聯檢試劑盒（PCR熒光探針法）	PCR熒光探針法	北京卓誠惠生生物科技股份有限公司	鼻拭子	甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒、副流感病毒I型及副流感病毒III型核酸。
六項呼吸道病原體核酸檢測試劑盒(PCR-熒光探針法)	PCR-熒光探針法	聖湘生物科技股份有限公司	有	本試劑盒用於定性檢測人咽拭子樣本中甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒、人鼻病毒和肺炎支原體的核酸。

核酸測試有助於檢測和鑒定難生長或不可培養的致病菌，如軍團菌、埃立克體、立克次體、巴貝蟲、疏螺旋體。此外，國家葯監局為應對重大突發公共衛生事件，出台了《醫療器械應急審批程序》，對涉及公共衛生問題的病原體檢測產品，如H1N1、埃博拉、新冠病毒等體外診斷試劑實行了快速審批，以新冠病毒檢測試劑為例，國家藥品監督管理局發佈《2020年度醫療器械註冊工作報告》顯示，2020年國家葯監局共批准了54個新冠病毒檢測試劑（25個核酸檢測試劑，26個抗體檢測試劑，3個抗原檢測試劑），其中核酸快速檢測產品包含8個，形成了全面的新冠檢測產品覆蓋體系，產能達到2401.8萬人份/天，助力疫情防控。

二 新一代宏基因組測序技術的應用

宏基因組測序技術 (metagenomics next-generation sequencing, mNGS) 直接對人體臨床樣本中的核酸進行高通量測序，然後與病原體數據庫進行逐一比對並分析序列信息，依據大數據分析比對得出的序列信息來判斷樣本所包含的病原微生物種類，該技術方法能夠檢測其中的多種病原微生物（包括病毒、細菌、真菌、寄生蟲等）[[4]]。能夠推進診斷方法發展和新病原體發現，推動感染病流行病學和病原體研究，為感染控制措施、公共衛生應對疫情和疫苗開發提供素材。

（一）檢測周期相對短

臨床傳統檢測方法目前依然是臨床一線檢測主要手段，但各種方法檢測周期不一。有的能夠快速得到結果，比如PCR及其衍生技術；但也有很大部分周期較長，像傳統培養平均3-5天，結核分支杆菌/非結核分枝桿菌要求培養42天。基於檢測方法的技術革新，mNGS 的病原體鑒定作為臨床實驗室檢測近幾年的新方法，在重症感染患者的臨床檢測及診斷中，給患者贏得了治療時間，減少其他嘗試性藥物的使用，綜合治療費用可能更低。mNGS測序對比可一次性測定幾百萬甚至上億條DNA或者RNA序列，極大的提高了全基因組測序效率，壓縮了檢測周期。

（二）陽性檢出率高

傳統的臨床檢測方法，對涵蓋細菌、真菌、病毒等的病原體，病原體診斷的金標準仍是培養結果為陽性，但實際檢測中絕大多數病原體不可培養，無法得出培養結果。關於mNGS應用於感染性疾病診治的研究，發現 mNGS 敏感性高於傳統培養，在結核/真菌/病毒和厭氧菌診斷方面優勢更明顯，比如一些常見方法不易檢測到的病原微生物，像努卡菌、病毒、無法培養的非典型病原和抗生素使用後無法生長的細菌。有文獻報道NGS為基礎的宏基因組測序在膿腫性病變病原檢測作用突出，陽性率高[[5]]。同樣具有較高的靈敏度和特異性的PCR檢測，其無法完成同時一次性多種病原體篩查，故檢出效率不高[[6]]。

（三）一次檢測覆蓋率廣

常規的臨床病原學診斷往往只能針對幾種目標病原體進行檢測，不能有效檢出臨床樣本中所有的病原體微生物，比如質譜方法在細菌檢測方面數量有限；免疫學方法操作簡單，但由於臨床樣本中病原體種類繁多，不能做到同時檢測多種抗原、抗體檢測。新一代的基因芯片技術僅能定向性篩查知的病原體基因組，對新的未知病原體無法檢測[[7]]。在臨床上超過 2/3 的感染性疾病因最終無法鑒定所感染的病原體，導致無法針對性地用藥，且臨床醫生對目標病原體的判斷水平參差不齊，經驗試錯情況時有發生[[8]]。

mNGS能在較短的時間內完成對樣本的無靶向檢測，單次即可檢測上千種病原體[[9]]。

（四）可以識別預期外和罕見的病原微生物

未知或變異病原體難以鑒定準確性，當前對未知病原體的鑒定，主要圍繞着病毒抗原檢測、核酸檢測和病毒分離培養三種檢測，病毒分離培養技術存在着缺陷，導致對未知病原體分析的準確性存在着一定的不足；而PCR檢測方法要求檢測病原體的序列必須已知。

近年來出現的新發病原體感染SARS病毒、埃博拉病毒、寨卡病毒等不斷湧現，傳統的檢測方法都無法對未知的病原體進行鑒定，mNGS可以在完全沒有先驗信息或者臨床傾向性的時候檢測到病原，對少見、罕見或者新發感染性病原體的鑒定、檢出方面具有絕對的優勢。

2017年，復旦大學華山醫院感染科張文宏教授團隊，應用NGS技術在1例眼內炎患者的玻璃體液中檢測到偽狂犬病毒(pseudorabies virus，PRV )，首次證實PRV可以感染人類，並引起眼內炎[[10]]。2016年利用NGS發現全球首例嗜冷桿菌相關腦膜炎[[11]]。

2015年在3例腦炎死亡患者標本中利用mNGS檢測到1種新型博爾納病毒，來源於斑駁松鼠的新型博爾納病毒經證實是一種人畜共患病的病原，可以導致人類嚴重的致死性神經系統感染。對於並非臨床常見而沒有在多數醫院常規開展檢測的囊蟲、布氏桿菌、螺旋體等病原體，或者培養方法較複雜或非常規開展的李斯特菌、奴卡菌等病原體，mNGS檢測可以規避常規檢查的不足[[12]]。以上這些都體現了mNGS在識別預期外和罕見的病原微生物方面的優勢。

（五）抗藥性、毒力、病毒分子分型

流行性的感染性疾病如：HIV、多重或廣譜耐葯的結核分枝桿菌、沙眼支原體等，一般均會具有較強的耐藥性，通過對耐藥性進行研究可以據此來選擇更加具有針對性的藥物對患者進行治療。高覆蓋度的mNGS可以獲取耐葯突變信息，評估病原體的葯敏性，有利於精確指導臨床用藥。

毒力分析在感染性疾病的預防中佔據着極為重要的地位，根據毒力可以對該感染性疾病的嚴重程度、轉歸進行評估。在mNGS測序中，目前主要是對高毒力細菌進行表徵[[13]]。

（六）排除感染

陰性結果有助於臨床增強中樞神經系統非感染性病因的證據。對於某個臨床樣本，mNGS 和mtNGS都為陰性的情況下，且內參檢測值提示該樣本中單位體積內（通常為 1 mL）已知最小病毒小於10個分子時，可以考慮陰性價值，即患者不存在感染性疾病，可能存在免疫性疾病和腫瘤等[[14]]。

2016年神經科領域的「感染性腦（膜）炎病因分型研究」是在國家科技部和衛計委領導下的第一批精準醫學十三五國家重點專項，空軍軍醫大學西京醫院趙鋼教授團隊聯合首都醫科大學附屬北京同仁醫院王佳偉教授團隊、河北醫科大學第二醫院卜暉教授團隊以及予果生物的重點專項研究，再次展現了mNGS的優勢：無需先驗性假設，改變傳統先猜再測的模式，克服了傳統靶向診斷的局限性；敏感性和特異性均高於傳統方法；可以檢測罕見病原和特殊病原；一次檢測，全面覆蓋，檢測範圍更廣、時間更短、效率更高[[15]]。

（七）mNGS面臨的挑戰

mNGS方法在病原感染方面的臨床應用方面，中國比美國走的更加靠前。但該方法仍然面臨若干挑戰，體現在檢測成本偏高等、對實驗環境要求嚴苛、部分檢測結果需人工解讀。

1 目前多數測序廠商提供的mNGS檢測服務，測序的數據量高達幾十兆，使得測序成本居高不下。如何在不影響準確度的前提下，減少mNGS的數據量，降低測序成本，達到如NIPT（「無創產前染色體非整倍體」）這種成熟NGS產品的標準，是對mNGS技術和應用的挑戰，但也會是行業發展趨勢。

2 由於環境中存在各種大量的微生物，從實驗室的空氣、生物試劑、耗材等都有可能檢測出微生物的核酸片段，因此不同於腫瘤、無創產前等NGS應用領域，病原微生物測測序需要有更高潔凈度的實驗室環境，避免背景和污染病原體對結果的干擾。

3 人體樣本，尤其是開放腔體的樣本，如肺泡灌洗液、痰液等裏面存在大量各種微生物，在NGS測序過程中不可避免的被檢測出來，因此如何解讀檢出各類微生物，並且判別哪些是致病病原體，對臨床來說仍然是一個挑戰。

總體來說，mNGS在感染性疾病的病原學篩查方面具有諸多優勢，對於一些進展快、起病急的感染疾病來說能夠在短時間內明確致病原微生物，快速為臨床診斷提供依據。與一些傳統方法如培養相比，陽性率高，當然陰性結果也具有排除感染的作用。並且能夠識別預期外和罕見的病原微生物，隨着數據量的增加及技術的發展，甚至能夠檢測耐藥性，分析毒力和病毒分子分型。

目前的mNGS經濟成本較高，短期內尚不太可能成為臨床一線檢測手段，但對不明原因發熱、初次抗菌治療無效、免疫缺陷等特殊人群中仍是一種有效的廣譜病原體篩查方法。此外，mNGS與傳統的分子、血清學檢測等方法在感染診斷的檢測中聯合使用可發揮關鍵作用[[16]]。

三 未來發展趨勢和展望

正如顯微鏡使微生物可見而打開了微生物學世界的大門，當今基因組學的技術進步為微生物學家提供了強有力的新方法，能以前所未有的分辨率表徵所有微生物背後的遺傳圖譜，從而闡明它們彼此之間、它們與環境以及人類健康之間的複雜和動態的相互作用。

感染病基因組學領域包含了廣闊的、研究活躍的前沿領域，有可能改變與感染病相關的臨床實踐。雖然遺傳學在闡明感染過程和管理臨床感染病方面一直發揮着關鍵作用，但基因組學將我們的思維和方法從單基因研究擴展到整個基因組序列、結構和功能，正在發現研究的新的可能性及改變臨床實踐的機會。

既有以前所未有的敏感性、特異性和速度的研發診斷方法，又有設計新穎的公共衛生干預措施，基因組學的技術和統計創新正在重塑我們對微生物世界對人類健康影響的認識。

參考文獻

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（完）