在過去數十年，用限制性內切酶產生黏性末端，在DNA連接酶的作用下，連接兩個甚至更多片段的克隆方法，是載體構建的經典方案。但是現如今我們再提到克隆的時候，遠遠不再只有傳統的限制酶克隆一種選擇。其中Gateway克隆技術作為一種可以快速、高效將DNA序列轉移到載體上的克隆方法已經流行開來。不要覺得Gateway克隆技術高深莫測，其實了解一下你就能懂。
Gateway克隆方法是λ噬菌體感染細菌時發生的整合和切割重組反應的體外形式。在體內，噬菌體（attP）和細菌（attB）的附着位點發生重組反應，噬菌體整合到細菌基因組中，兩側為兩個新的重組位點（attL-left-和attR-right-）。在某些條件下，attL和attR位點可以重組，導致噬菌體從細菌染色體上切除並重新生成attP和attB位點。
即Gateway技術依賴於下面描述的兩個反應：BP反應和LR反應，通過BP反應獲得入門克隆(有時候我們也說中間克隆)，再通過LR反應將目的DNA以正確的方向連接到各種目的載體上，形成不同的表達載體。GeneCopoeia的 EZShuttle™重組克隆體系應用E.coli和λ噬菌體特異位點的重組酶促體系使 DNA片段在載體間相互轉換，其原理與 Gateway克隆技術相同。
BP反應-構建入門載體：
通過PCR將attB位點添加到目的DAN序列兩側，形成attB-PCR產物。用attB-PCR產物或者含attB位點的供體質粒和含attP位點的質粒發生重組生成入門克隆。
EZRecombinase BP混合物，RCBM-1002-020
LR反應-構建表達載體：
製作表達載體時，選擇適合的目標載體非常重要。這種選擇取決於許多因素，如宿主類型，所需的表達水平和實驗目的。選定的attR表達載體與attL-入門載體重組以產生表達載體。
EZRecombinase LR混合液，RCBM-1001-020
文章來源：每日生物評論
歡迎關注微信公眾號：每日生物評論，或Bio-review
用最專業的精神，開放性的思維，與你一起探索行業走向，快速了解這個領域！
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-