作者：龍秋月 鄭雅莉 高占成
單位：廈門大學附屬翔安醫院呼吸與危重症和睡眠醫學科；北京大學人民醫院呼吸與危重症醫學科
引用本文:龍秋月, 鄭雅莉, 高占成. 新型冠狀病毒檢測技術研究進展 [J] . 中華結核和呼吸雜誌, 2022, 45(8) : 819-825. DOI: 10.3760/cma.j.cn112147-20220326-00240.
摘要
儘管自然感染或疫苗接種已經初步建立了群體保護屏障，但隨着多種新冠病毒變異體的持續出現，突破性感染仍然無法完全避免，新冠病毒檢測仍是發現傳染源和中斷傳播鏈的關鍵。目前，以核酸、抗原、抗體檢測為基礎的新冠病毒檢測形式呈多元化發展。在相對疫情早期的後新冠時代，復工復產和疫情防控常態化，需要我們根據不同場景的防控需求選擇合適的檢測手段。本文總結了現有新冠病毒檢測技術的原理及其適用特徵，以期為臨床及公共衛生人員提供精準化決策依據。
嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（SARS-CoV-2，簡稱新冠病毒）是21世紀繼嚴重急性呼吸綜合征（severe acute respiratory syndrome，SARS）和中東呼吸綜合征（Middle East respiratory syndrome，MERS）後引發重大公共衛生事件的第三個β屬冠狀病毒。作為正鏈RNA病毒，其基因組可編碼16種參與RNA轉錄和複製的非結構蛋白，以及包括刺突（spike，S）蛋白、包膜（envelope，E）蛋白、膜（membrane，M）蛋白、核衣殼（nucleotide，N）蛋白在內的4種主要結構蛋白。2019年末，武漢突發不明原因肺炎，通過病毒分離培養和核酸鑒定技術首次明確了新冠病毒。疫情早期，隨着新冠病毒擴散、新冠肺炎病例激增，以核酸為靶標的實時熒光定量聚合酶鏈反應（real-time polymerase chain reaction，RT-PCR）精準診斷技術對檢出陽性個體、阻斷傳播鏈、制定防控措施起到了關鍵作用。在相對疫情早期的後新冠時代，自然感染或疫苗接種逐步建立了抵抗病毒入侵的免疫防線，相當一部分傳染源歸因於無癥狀感染，對大規模疑似患者及密切接觸群體的快速篩查成為關注重點。在此背景下，基於核酸、抗原和抗體檢測的新冠病毒診斷技術多元化，基於成簇規則間隔短迴文重複序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）和生物傳感器原理等新興探測手段得到開發應用。本文就已報道新冠病毒檢測技術的原理及其適用特徵進行綜述，以期幫助讀者了解併合理選擇診斷方式。
一、病毒分離培養
病毒分離培養可用於識別和擴增具備複製能力的活體病毒，長期以來都被視為實驗室診斷病毒感染的金標準。臨床樣本來源的病毒懸液接種於實驗動物或病毒嗜性細胞可實現分離毒株的純化和擴增培養，用於後續鑒定分型和病原學表徵。新冠病毒的分離培養必須在生物安全三級實驗室進行，鑒於血管緊張素轉換酶2（angiotensin converting enzyme 2，ACE2）受體是新冠病毒侵入宿主細胞［1］的關鍵，現用於培養新冠病毒的主要細胞係為表達豐富ACE2受體的Vero或Vero E6猴腎細胞［2］，同時採用終點滴定法或噬菌斑法，可量化病毒感染滴度。終點滴定法［3］通過觀察感染細胞的細胞病變效應來判定50%組織培養感染劑量（TCID50）；噬菌斑法［4］則是計數病毒感染的單個細胞所形成單個噬菌斑，即噬菌斑形成單位（PFU）數量。雖然目前高敏感度和特異度的分子檢測技術已成為病毒病原學診斷的主流方法，但出於鑒定和研究新興病原體（如新冠病毒）的目的，病毒分離培養技術的地位仍不可替代，主要體現在［5, 6, 7］：（1）作為核酸及血清學檢測方式性能評估的參考；（2）驗證預防、治療類藥物製劑及中和抗體的抗病毒效果；（3）為致病機制研究、流行病學調查和滅活病毒疫苗研發提供毒種資源；（4）明確樣本是否具備傳染性。然而，新冠病毒的分離培養時長可達4~6 d［8］，安全防護要求高，無法成為疫情形勢下儘早篩查疑似患者的常規手段。
二、病毒核酸檢測
（一）全基因組測序
基於下一代測序原理的宏基因組（Metagenomic next-generation sequencing，mNGS）技術是目前臨床最常用的高通量和實現全基因組測序的病原學診斷方法，可對樣本來源的所有DNA或RNA核酸分子進行測序，無需靶標富集和擴增，即可實現樣本中細菌、病毒、真菌和寄生蟲等微生物基因組的並行表徵，具有“無偏泛病原體檢測”的特性［9］。新冠病毒的檢測由基於RNA的mNGS程序執行［10］，疫情伊始，藉助mNGS技術，中國科學家在5 d內即明確了不明原因肺炎的致病原為一種Sarbe亞屬的新型β屬冠狀病毒［11］，進化分析結果顯示，其基因組序列與蝙蝠來源毒株最為接近、與SARS冠狀病毒同源性高達79%。另外，Mostafa等［12］報道，在mNGS鑒定為陽性的40份鼻咽拭子樣本中，RT-PCR僅能檢出77.5%（31/40），同時，還發現患者上呼吸道微生物多樣性差異與疾病嚴重程度顯著相關。因此，mNGS不僅是追蹤病毒進化譜系、表徵變異株基因序列和亞單位疫苗研發基礎手段，還是精準評價新冠肺炎患者呼吸系統微生態特徵性變化的有效工具。然而，該技術的整體工作流程尚無統一標準，其程序的複雜性決定了檢測周期至少耗時24 h［13］，平均約48 h甚或更長，對於新冠肺炎患者的早診斷並不佔據優勢。
（二）基於PCR的核酸檢測
基於對病毒遺傳物質——核酸序列的擴增，RT-PCR可從混合物中檢測到極少量的病毒存在，是新冠肺炎的首選診斷方法和確診金標準。該技術包括逆轉錄步驟和聚合酶鏈式反應［14］，逆轉錄產物擴增的同時伴隨着熒光信號的產生，由此形成可量化反應系統被熱循環儀捕獲。熒光值達到界定閾值時的循環數被稱為閾值循環［15］（Cycle threshold，Ct），是判斷核酸檢測結果的重要參數，Ct值越低，代表樣本中病毒負荷越高。世界衛生組織（WHO）於2020年中公布了多國權威機構針對N、E、RdRP和ORF基因設計的引物和探針靶向序列，隨後Jung等［16］的研究表明，這些引物-探針組合對新冠病毒均具有高度特異性，且未觀察到與其他呼吸道病毒存在交叉反應。目前，我國推薦將N基因和ORF1ab基因並行作為新冠病毒核酸檢測的靶標［17］，同一樣本滿足雙靶標陽性或單靶標重複檢測陽性則可判定為陽性結果。相對來說，S基因序列在已報道的變體中屬於突變高發區［18］，雖不適於作為新冠病毒變體診斷的通用靶標，但對於突變位點的鑒定和各類變體的識別卻大有裨益。Xiong等通過數據庫比對分析鑒定出Alpha和Delta病毒株S基因的特徵性突變C1709A，由此設計了靶向引物使得RT-PCR可用於以上兩種變體的特異性診斷［19］。
值得一提的是，數字PCR（Droplet digital，dPCR）是以有限稀釋為基礎、以泊松分布為原理、以絕對定量為核心的第三代PCR技術［20］。其不受反應效率和引物特異性影響，無需外部對照即可獲得絕對定量。在相同實驗條件下，dPCR對新冠病毒ORF1ab和N基因的檢出極限分別為2.1和1.8 個拷貝/ml，而RT-qPCR分別為1 039和873.2個拷貝/ml［21］。相關臨床研究表明［22, 23］，儘管dPCR的拷貝數與RT-PCR的Ct值高度相關，但前者報告的假陰性結果更少，對於低病毒載量樣本的檢測是更為靈敏和準確的工具。我國《2019新型冠狀病毒核酸檢測專家共識》［24］提及，當核酸檢測Ct值介於灰度區時，可採用敏感度更高的dPCR方法進一步確定。但鑒於高成本和低通量的局限性，dPCR並未在臨床病原學診斷中普及。
（三）基於等溫擴增的核酸檢測
相較於PCR技術，等溫擴增核酸檢測簡化了熱循環反應過程，縮短了檢測周期。以環介導等溫擴增（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）［25］為例，該方法利用4~6個引物識別目標序列的不同區域，在恆定溫度（60~65 ℃）下通過莖環結構進行反覆擴增，1 h合成的目標基因多達109拷貝。用於新冠病毒的核酸檢測的LAMP技術增加了逆轉錄步驟，在此基礎上，將副產物焦磷酸鎂引起的濁度變化放大［26］，則可通過濁度計判斷擴增結果，同一研究還證實，LAMP與RT-PCR具有相似的敏感度。其他研究［27, 28］也表示，LAMP方法用於新冠樣本檢測可達到90%~100% 的敏感度和95%~99% 的特異度，同時多靶標還提高了擴增的準確性，檢測時間卻僅需30 min。此外，新冠病毒變體Alpha、Beta、Gamma、Delta和Omicron在N基因12~213鹼基序列區高度保守，Luo等據此優化了引物設計［29］，使得LAMP技術對新興變體的診斷具有兼容性。其餘等溫擴增核酸檢測方法還包括重組聚合酶擴增、滾環擴增和基於核酸序列擴增［30］，但在新冠病毒診斷方面的應用相對少見。綜上，等溫擴增技術具備高特異度、高敏感度、高效率、設備簡化的優點，但其多引物、多酶的反應體系需求同時也加大了檢測設計和研發的複雜程度，我國葯監局批准的新冠病毒核酸檢測試劑盒中僅有兩款採用了等溫擴增技術。
（四）基於CRISPR的核酸檢測
CRISPR的原理為嚮導RNA（guide RNA，gRNA）引導下實現的Cas蛋白酶核酸剪切功能。具體來說，根據新冠病毒的RNA序列可設計特異性靶向gRNA，理論上，只要樣本中存在病毒靶向序列，gRNA就能對其進行精準識別並激活Cas蛋白酶執行報告核酸分子切割功能，使得信號分子得以釋放、捕獲。張鋒團隊利用CRISPR-Cas 13a系統開發的SHERLOCK技術［31］是該領域的典型代表，結合重組聚合酶等溫擴增技術，在術前患者篩查中平均檢測耗時約70 min，檢出下限為42拷貝/ml，熒光讀數的特異度和敏感度均達100%，側流讀數分別達100%和97%［32］；為簡化流程，該團隊還採用了LAMP法將RNA擴增和Cas酶切割步驟合二為一，不到1 h即完成了核酸檢測，檢測限為RT-PCR的三十分之一（33拷貝/ml和1 000拷貝/ml）［33］。在此基礎上，de Puig等設計了靶向新冠病毒變體突變序列的gRNA，拓展了該技術在即時鑒定N501Y、E484K 等變體相關突變位點方面的應用［34］。另外，Broughton及其同事報道了第一個基於CRISPR-Cas 12系統的DETECTR技術［35］，實現了45 min內對新冠病毒的定性檢測。Liang等利用該技術開發了新冠病毒S基因分型的多重檢測，實現了Alpha、Beta、Delta變體的快速鑒別［36］。CRISPR的酶反應特質和gRNA選擇賦予了該技術高敏感度、高特異度和靈活靶向性的優勢，但其優良效能應用於臨床診斷的普適性仍有待證實。
三、病毒抗原檢測
核酸檢測和抗原檢測都是直接靶向新冠病毒的檢測方式，前者用於檢測感染早期階段活躍複製的病毒，而後者則利用特異性抗體對病毒特定蛋白進行鑒定。N蛋白在進化上高度保守，是新冠病毒抗原檢測的主要靶標［37］。現今報道的抗原檢測多基於側流免疫反應（Lateral flow immunoassay，LFIA）原理，這是現場即時檢測（Point-of-care tests，POCT）的最主流形式，15 min左右即可獲得結果［38］。該技術通過毛細流驅動樣本液滴流過層析條（圖1），樣本中的待測分子（特定抗原）會先與結合區中的一部分標記分子聯結，檢測條帶（T）區可捕獲待測分子-標記分子聯結體並與其反應轉換為顏色信號，以定性檢測特定抗原；而質控條帶（C）區可與未聯結的標記分子反應，以反映同一檢測的質控水平［39］。我國於2022年3月上市的第一批新冠病毒抗原自測試劑盒均以LFIA原理為基礎，不同之處在於其採用的標記分子和信號讀取設備不一，可選擇膠體金、乳膠微粒或熒光分子。快速抗原檢測的敏感度與病毒載量相關，在無癥狀感染者中證據仍然有限［40］。研究發現［41］，在Ct值低於25的樣本中，敏感度為97%~100%；在Ct值介於25~30的樣本中，敏感度為50%~81%；而在Ct值高於30的樣本中，敏感度低至12%~18%。相應的，WHO關於新冠病毒快速抗原檢測的文件［42］指出，快速抗原檢測的結果在存在社區傳播的地域最為可靠。因此，抗原檢測無法替代核酸檢測成為確診標準，然而，對於不具備核酸檢測能力的基層衛生機構、感染風險相對較高的社區居民和大規模復工復產人群，抗原檢測是低廉、便利的有效篩查工具，有助於早發現病例，早中斷傳播。
圖1側流免疫反應（LFIA）原理示意圖
四、抗體檢測
新冠病毒入侵人體後，固有免疫和適應性免疫系統相繼激活，通常在感染後1~2周內，病毒特異性IgM抗體出現繼而緩緩衰退，而在感染2周左右，IgG抗體產生並可在體內維持較長時間，故IgM可用於提示近期感染，IgG則可用於提示既往病毒感染史。N蛋白和S蛋白S1亞基具有強免疫原性，是新冠病毒血清學檢測中最常見的生物標誌物［43］。我國第九版診治指南指出［8］，特異性IgM抗體和IgG抗體均為陽性者可確診新冠肺炎。但新冠疫苗接種者或既往感染新冠病毒者也會發生血清學轉換，故而該指標對其無診斷性參考意義，僅可作免疫屏障建立後評價體液免疫反應的重要工具，如測定抗體水平隨時間推移的衰減程度和針對變異毒株的抗體有效性。血清學檢測的常見方法包括酶聯免疫吸附試驗（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）、化學發光免疫分析法（Chemiluminescence analysis，CLIA）和以LFIA原理的POCT設備。ELISA是一種基於微孔板的測定技術，可實現肽段、蛋白質、抗體等分子的定性或定量檢測，檢測周期1~5 h［44］。孔板中包被的病毒抗原可與樣本中特異性抗體發生特異性結合，隨後抗原-抗體複合物同標記分子相連即可產生與抗體濃度呈正相關的比色或熒光信號。CLIA法採用化學發光強度來量化樣本中的抗體水平，具有高信號強度、寬檢測範圍、無散射光干擾的優勢［45］，每24小時可以執行上4 000次檢測［46］。研究表明［47, 48］，CLIA應用於檢測多抗原的特異性高於單抗原，用於檢測總抗體水平時效能最好。至於LFIA產品，其便攜、效率高且樣本量僅需幾微升，適用於指尖採樣［49］。然而，無論何種血清學檢測技術，其效能都與採樣時間密切相關，Nicol等［46］使用ELISA、CLIA和LFIA技術針對293例樣本的IgG進行了評估，發現以上方法均在確診14 d後敏感度最高，達100%；Pickering等［50］也報道了抗體檢測在首發癥狀後20 d採集的樣本中具有最高的敏感度和最窄的置信區間。因此，鑒於血清學轉換時間窗約1~2周，血清學檢測在疾病初期診斷新冠肺炎的效用有限。
五、基於宿主呼吸代謝物的檢測
宿主呼出氣體代謝物的檢測被稱為呼吸分析，是一種隨代謝組學興起的無創且實時的POCT方式，通過質譜-色譜技術檢測關鍵揮發性有機化合物（Volatile organic compounds，VOC）實現，具有明確診斷和大規模篩查的潛力。在呼吸道感染、阻塞性肺病及肺癌等領域，宿主代謝微環境的擾動對於肺部疾病發生髮展的重要作用已有所闡明［51］。Grassin-Delyle等［52］對新冠肺炎患者的呼出氣代謝物進行了表徵，發現其中4種VOC（甲基戊二烯醛、2，4-辛二烯、1-氯庚烷和壬醛）可用於有效區分新冠相關急性呼吸窘迫綜合征與非新冠急性呼吸窘迫綜合征，在40例測試患者中，敏感度和特異度分別達90%、94%。另Chen等［53］通過以丙酮佔主導的12種VOC成功區分了新冠患者和健康對照，且該診斷模型可檢測出核酸檢測呈假陰性的感染者。美國食品藥品監督管理局（FDA）於2022年4月頒發了首個用於判斷新冠病毒感染的呼吸分析儀（InspectIR）的緊急使用授權，其主要檢測呼出氣體中新冠病毒感染特徵性的5種酮類和醛類VOC，代謝物檢測限為10ppb，3 min內即可獲得結果［54］。在一項納入了2 409例確診新冠肺炎患者（PCR陽性率僅為4.2%）的大型隊列中，該技術被證明具有91.2%的敏感度和99.3%的特異度，且陰性預測值高達99.6%；此外，針對Omicron變體檢測，該技術具有90.9%（10/12）的相似敏感度［55］。需注意的是，FDA指出，該項測試可用於篩查暴露史不明確的無癥狀個體，但不能作為患者管理和治療的唯一決策依據，其結果應同個體臨床癥狀和體征、分子診斷報告綜合考慮。
六、新興生物傳感器
生物傳感器是一種對生物物質敏感並通過理化換能器及信號放大器將其濃度轉換為電信號進行檢測的儀器，旨在優化現有生物分子檢測手段。對於核酸檢測，Peter等基於CRISPR-SHERLOCK技術研製了可穿戴的生物傳感器［56］，將該技術集成至標準口罩中檢測呼出氣溶膠內的新冠病毒，在90 min內給出的準確度可與金標準RT-PCR相媲美。最近Wang等［57］還報道了基於石墨烯場效應晶體管的微機電傳感系統，無需核酸提取和擴增步驟，在33份鼻咽拭子樣本中（Ct值24.9~41.3）不到4 min即可對新冠病毒進行鑒別；同時在54份陰性樣本中未出現假陰性結果，檢測限低至10~22拷貝/ml。對於抗原檢測，Raziq等［58］首次以分子印跡聚合物作為生物靶標識別元件，開發了針對新冠病毒N蛋白的電化學傳感器，反應時長15 min，檢測限和定量限分別達15 fM和50 fM（0.7~2.2 ng/L），與真實世界樣本中的抗原濃度匹配。對於血清學檢測，Elledge等報道了一種基於分裂式熒光素酶-目標抗原融合蛋白的抗體檢測方法［59］，靶向抗新冠病毒S蛋白（S-Sensor）和N蛋白（N-Sensor）抗體，可在30 min內實現血液、唾液中低水平抗體的定量分析。在對臨床樣本的驗證中，N-Sensor和S-Sensor的特異度分別達99.2%、100%，敏感性分別達98%、89%，且與季節性冠狀病毒樣本未發生交叉反應性。上述模塊均可搭載於便攜裝置以朝POCT設備方向改造，因此，綜合時效性、簡便性、特異度、敏感度來看，生物傳感器有望發展成為社區篩查甚至是臨床實驗室診斷的高效工具。
七、總結與展望
隨新冠疫苗的大範圍接種，群體免疫屏障基本建立，然而，適應宿主的新型變異毒株不時更迭，突破性感染的發生難以完全避免，在疫情防控常態化的形勢下，新冠病毒的檢測仍是發現傳染源和部署公共衛生策略的基石。不同檢測手段各有側重（表1［19，27, 28, 29，33, 34，36，46，50，60, 61, 62, 63, 64］），互為補充，但在實際應用中仍需結合流行病學史、臨床表現和基礎疾病等綜合考慮以避免誤判。從生物靶標來看，核酸檢測和抗原檢測分別以病毒遺傳物質和功能分子為靶標，抗體檢測和呼吸分析則以人體病毒特異性免疫反應或代謝變化為靶標；從檢測時間線來看，核酸檢測和快速抗原檢測在急性期即可用於診斷新冠病毒感染，其中，前者具有相對更低的檢出下限，抗體檢測則於起病1~2周發生血清學轉換後效能最好；從適用特徵來看：（1）基於核酸擴增檢測的分子診斷技術敏感度高、特異性強，仍是明確新冠病毒感染的首選，LAMP技術有潛力成為RT-PCR的替代；（2）抗原檢測和呼吸分析在操作性和時限性方面佔據優勢，是基層醫療機構分流和大規模人群篩查的便捷方式，有助於確保社會活動的正常運轉；（3）血清學檢測是病程中後期的重要診斷工具，也是監測抗體反應的基礎手段；（4）新興CRISPR技術和生物傳感器策略綜合實力優異，應用前景廣闊，有待於在大樣本臨床隊列中得到印證。
後新冠時代的陽性病例可能以無癥狀或潛伏期感染者常見，低病毒載量情況下敏感度偏低的檢測方法（如快速抗原檢測）檢出率或會下降，與此同時，鑒於新冠病毒適應性突變的持續，基於高度保守序列的普適性檢測和基於特徵性突變位點的變體診斷需統籌兼顧。因此，單一檢測技術無法成為兼具高效能和高效率的理想診斷方式，病毒導向性和宿主導向性的聯合檢測策略可隨場所變換、病期推移和變體更迭為病例監測和疫情防控提供多重保障，是後新冠時代新冠病毒檢測的演變趨勢。
參考文獻（略）
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