影像學檢查和腫瘤活組織檢查是臨床上腫瘤診斷和監測的主要手段，這些檢查在治療前的確非常有效，但是頻繁和重複的影像學檢查及活檢用於術後監測是不切實際的。液體活檢（Liquid biopsy）技術是指通過採集和檢測人體體液樣本實現腫瘤監測的一種技術，雖然尿液、糞便、腦脊液、唾液、腹水等體液都是腫瘤源性物質的潛在來源，但血液仍然是主要的液體活檢樣本。
相比於傳統的腫瘤檢測方法，液體活檢技術具有取樣方式靈活、無創便捷、可以反覆多次取樣、依從性高等特點，因此可能在腫瘤篩查、療效檢測、用藥指導等方面發揮重要作用。
液體活檢與HPV病毒
液體活檢樣本中存在多種攜帶腫瘤相關信息的物質，包括循環腫瘤細胞、循環腫瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）和RNA、腫瘤細胞釋放的外泌體等等。其實正常人的血液中，也含有一些片段化的DNA，我們稱之為cfDNA，科學家認為這些cfDNA是通過細胞凋亡或者壞死釋放到血液中的，進入血液之後，cfDNA會被快速從血液中清除，半衰期不超過1小時，健康人血漿中的正常細胞的cfDNA含量是比較低的。
而ctDNA就是指從腫瘤細胞中釋放出來的DNA，與正常的cfDNA在序列特徵上有一些差別，因此，通過對血漿中ctDNA進行測序，就可以了解很多腫瘤的相關信息，尤其是對於某些病毒感染引起的腫瘤，其cfDNA中往往含有很多病毒特異性的基因信息。
人乳頭瘤病毒（human papillomavirus，HPV）是一種廣泛感染人類的病毒，大多數HPV的感染對人體無害，在兩年內可以被人體的免疫系統自行清除，但持續的高危型HPV感染可以導致多種癌症的發生，對全人類的健康造成嚴重威脅。
在美國，每年有1400萬人感染HPV病毒，大多數人一生中至少會感染1次HPV病毒，每年與HPV相關疾病（疣、癌前病變、癌）相關的總醫療費用高達80億美元。2009年，美國估計有34788例新發性與HPV相關癌症，包括宮頸癌、肛門癌、口咽癌和外陰癌等，其中最常見的口咽癌和宮頸癌，這些癌症中很大一部分由HPV16型和18型引起。
圖1 HPV 16型病毒粒子結構
在HPV病毒引起的腫瘤中，通過病毒基因組可以區分ctDNA和正常細胞來源的cfDNA，因此，可以對患者血漿中cfDNA進行檢測來了解患者的腫瘤負荷情況。
ctDNA可作為HPV引起腫瘤監測指標
一項研究探討了HPV相關的ctDNA作為口腔鱗癌複發的指標可行性。HPV引起的口腔鱗癌治療效果遠遠優於非HPV感染的口腔鱗癌，然而仍然有10%~25%的患者會在治療後出現疾病複發。CtDNA水平的動態變化與腫瘤的轉移或者患者的治療反應相關。
有研究納入了115例HPV相關的口腔鱗癌患者，所有患者均接受治療性放化療（CRT），患者接受3個月的治療性放化療後PET-CT，在之後的1~2年中，每2~4個月進行臨床評估，在3~5年期間每6個月進行一次評估。每6~9個月收集一次患者血液樣本，使用多重分析數字化PCR分析血漿中的HPV相關ctDNA，所有患者的中位隨訪時間為23個月。
圖2 DOI：10.1200/JCO.19.02444
其中，15名患者出現疾病複發，87例患者在治療後各個時間點均沒有檢測到HPV相關ctDNA陽性，這些患者也均未出現複發，28名患者在治療後監測中出現ctDNA陽性，其中15人複發，而16名患者連續2次血液檢測呈現陽性，複發的15名患者均在其中。HPV相關的ctDNA陽性與活檢證實複發之間的平均時間為3.9個月。
這項研究證實，基於HPV相關的ctDNA檢測用於HPV相關腫瘤複發的監測是可行的，其他一些類似的研究也驗證了這一結論。
然而，當下的ctDNA檢測多採用定量PCR（qPCR）和數字化PCR（dPCR），存在精度不夠的問題，當DNA的拷貝數小於1時，採用這些方法檢測會有一些困難，如何提高檢測的敏感性，是科學家一直關注的問題。
超高HPV ctDNA檢測助力腫瘤液體活檢
近日，來自加拿大多倫多的瑪嘉烈公主癌症中心的研究人員在Clinical Cancer Research上發表了一篇題為HPV sequencing facilitates ultrasensitive detection of HPV circulating tumor DNA的文章，這項研究提供了一種超敏感的HPV特異性ctDNA的檢測方法，HPV-seq大大提高了檢測的敏感性，能夠在dPCR陰性的治療後樣本中檢測到低至0.03 拷貝/ml的ctDNA。
圖3 DOI：10.1158/1078-0432.CCR-19-2384
圖4 HPV-seq和雙鏈雜交捕獲原理
HPV-seq採用了一種雙鏈雜交捕獲的方式從序列文庫中富集病毒DNA，能夠定性和定量地提供HPV相關腫瘤患者ctDNA的信息，不僅具有超高的敏感性，而且能夠提供ctDNA的片段長度和HPV基因型信息。每個全長的病毒基因組大約能夠產生50種不同的cfDNA片段。
結果顯示，HPV-seq 的結果和dPCR具有高度相關性，而且能夠檢測出dPCR不能檢測到的ctDNA，治療結束後檢測到HPV ctDNA與較差的無病生存期相關，其對疾病複發預測的敏感性為100%，特異性為67%。對HPV型別鑒定的準確率達到100%。HPV ctDNA片段的大小始終短於非癌症來源的cfDNA片段，並且在HPV基因組中觀察到固定的cfDNA片段組模式。
總之，本研究提出的HPV-seq確實是一種有效的ctDNA定量方法，優於傳統的dPCR。
通過這種超高敏感性的檢測方法，可以迅速發現患者是否有腫瘤複發的傾向，更早地採取行動，對於提高患者預後具有重要意義。同時，這項技術也可以用於其他由特定病原體引起的癌症的檢測和治療，造福更多腫瘤患者。
作者：殷其雷
來源：臨床前線
參考資料：
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